Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 112

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 106 107 108 109 110 111 < 112 > 113 114 115 116 117 118 .. 162 >> Следующая

факторов, например, присутствия пыли в растворе ДНК, в случае
толстостенной иглы это могут быть маленькие капельки масла, прилипшие к
внутренней поверхности кончика иглы, когда она заполнялась раствором ДНК-
Иногда иглы закупориваются белками, захватываемыми в процессе инъекции,
обычно это происходит при лизисе яиц. Часто удается откупорить иглу,
очень осторожно приблизив ее к отверстию удерживающей пипетки. Если
удалить пробку не удастся или кончик иглы обломится и образует слишком
широкое отверстие, следует взять новую иглу. Дефекты инъекционной иглы
обычно приводят к лизису яйца. Степень лизиса может различаться от
полного (рис. 11.3, А) до частичного, при этом по ходу культивирования
может произойти регуляция дефекта (рис. 11.3,?), но большинство таких яиц
не достигает 2-клеточной стадии.
У старой иглы ее наружная поверхность становится липкой от белков яйца.
Несмотря на то что такие иглы инъецируют хорошо, они могут захватывать и
извлекать ядрышки, когда игла выводится из пронуклеуса (рис. 11.3, В). В
результате сквозного прободения ядра инъекционной иглой ядрышки
выталкиваются с противоположной стороны ядра под действием давления
введенного раствора ДНК (рис. 11.3,Г). Такие яйца редко развиваются.
Использование удерживающих пипеток не вызывает столько проблем, но и эти
пипетки при длительном хранении иногда закупориваются крупными частицами
пыли. Пузырьки воздуха на границе масла могут привести к тому, что
пипетка перестает реагировать на изменение давления масла. Слишком
сильное присасывание яйца к пипетке может привести к его повреждению.
Если блестящая оболочка лопнет или в ней образуется отверстие, содержимое
яйца может оказаться втянутым внутрь пипетки.
3.5. Трансплантация эмбрионов
В некоторых лабораториях оперированные яйца трансплантируют
псевдобеременным самкам 1-го дня вечером в день инъекции. Мы обычно
переносим 2-клеточные эмбрионы на следующее утро после операции (см. гл.
13, разд. 6.4). На это есть три причины. Первая заключается в том, что
эмбрион должен оправиться после микроинъекции прежде, чем будет
подвергаться переносу. Вторая, и более существенная, связана с тем, что у
39*
292
Глава 11
значительного процента оперированных эмбрионов развитие блокируется на 1-
клеточной стадии (10-20%) и нужно время, чтобы убедиться в отсутствии
блока и целесообразности переноса. Блок развития на 1-клеточной стадии
может происходить либо в результате свойств раствора ДНК, как обсуждалось
выше, либо вследствие прямого физического повреждения яйца при
микроинъекции. Третья причина состоит в том, что асинхронный перенос
больше соответствует замедленному развитию яиц, которое обусловлено
оперативным вмешательством.
4. Скрининг трансгенного потомства
4.1. Аутопсия хвоста и прищипывание пальца
После переноса эмбрионов в яйцевод приемной матери необходимо время от
времени наблюдать за течением беременности, в частности, в середине срока
взвесить реципиента. Если к вечеру 20-го дня не произойдет благополучных
родов у явно беременной мыши, следует произвести кесарево сечение, так
как число живых плодов может быть недостаточным для индукции естественной
родовой деятельности (см. гл. 1, разд. 5.6).
В нашей колонии мышей здоровое потомство отсаживается на 21-й день после
рождения. В это время мышата достаточна велики для выявления
инъецированных последовательностей ДНК путем биопсии хвоста для
последующего анализа ДНК-Биопсия хвоста и нумерование животных
прищипыванием пальца должны быть сделаны одновременно для экономии
времени и во избежание возможных ошибок. Можно маркировать животных
отверстиями в ушах (гл. 1, разд. 3.2), но мы не советуем этого делать в
данном случае; этот метод следует оставить для кратковременных
экспериментов.
1. Анестизируйте животное авертином, возьмите его в руку, брюшком вверх,
и прищипните отдельные пальцы маленькими острыми ножницами. Убедитесь,
что отрезана достаточная часть для идентификации мышонка. Удаляя не более
2-х пальцев на конечность, можно индивидуально пометить колонию из 10 000
животных, как показано на рис. 11.4. В частности, обратите внимание, что
порядок прищипывания от крайнего пальца к среднему (начиная с наименьшего
пальца и двигаясь к большому) должен быть сохранен на всех четырех
конечностях. Мы находим эту систему прищипывания более удобной, чем
принятая во многих лабораториях система только слева направо.
2. Сразу же после прищипывания удалите терминальную треть хвоста острыми
ножницами и немедленно прижгите
Получение трансгенных мышей
293
Рис. 11.4. Способ нумерации мышей прищипыванием пальца. Метод
иллюстрирован схемой для правой передней лапы. Для безошибочной
идентификации палец отрезается не меньше чем наполовину. Паттерн
повторяется для всех четырех конечностей в латерально-медиальном
направлении (т. е. единицы н сотнн читаются слева направо, а десятки н
тысячи - справа налево).
культю горячим бритвенным лезвием. Ткань хвоста разрежьте ножницами на
Предыдущая << 1 .. 106 107 108 109 110 111 < 112 > 113 114 115 116 117 118 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed