Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
отработаны надежные условия активации яиц. Активацию неоплодотворенных
яиц можно стимулировать разнообразными воздействиями [9, 10]. Мы опишем
метод получения гаплоидных и диплоидных парте-ногенетических яиц, которым
обычно пользуемся, - метод Кат-бертсона. Он основан на использовании
этанола в качестве активирующего агента [11, 12].
1. Соберите яйца от суперовулировавших, но неспаривав-шихся самок через
17-18 ч после инъекции чХГ.
2. Удалите клетки кумулюса обработкой гиалуронидазой (гл. 2, разд. 2.1) в
РВ1 (гл. 13, разд. 3.1.1) и отмойте яйца в трех каплях М16+ВСА (гл. 2,
разд. 5.2), а затем в трех больших каплях 7%-ного этанола в М16 + БСА.
3. Держите яйца в третьей капле спирта, пока не пройдет 4,5 мин от
момента помещения их в первую спиртовую каплю. За минуту до конца этого
периода захватите яйца в пипетку с небольшим объемом спиртовой среды и по
прошествии 4,5 мин осторожно выпустите их в большую каплю М16+БСА для
отмывки. При смешивании двух сред образуется воронка; попав в нее, яйца
могут всплыть на поверхность капли и прилипнуть, если не помочь им
опуститься на дно. Отмойте яйца проводкой по 6 каплям М16 + БСА.
4. Если требуются гаплоидные партеногеноны, культивируйте яйца в среде
М16+БСА под маслом при 37,5°С, это приведет к формированию второго
полярного тельца. В течение 4 ч сформируется гаплоидный пронукле-
Трансплантация ядер в яйца
311
ус и второе полярное тельце полностью выделится.
5. Для получения диплоидных партеногенон необходимо подавить
формирование второго полярного тельца, при этом оба продукта второго
мейотического деления останутся в развивающемся яйце. Сразу после
активации и отмывки перенесите яйца в большую каплю под маслом среды М16
+ БСА+цитохалазин В (5 мкг/мл). (Исходный раствор разводят в ДМСО до
концентрации 2 мг/мл.) Инкубируйте в течение 3-4 ч. К этому времени в
цитоплазме будут четко видны два пронуклеуса. Очень осторожно отмойте
яйца. Для этого проводите их по девяти большим каплям М16 + БСА и
возвратите в культуру. Спустя 2 ч, когда яйца оправятся от обработки, их
следует тщательно просмотреть и все аномальные отбросить.
2.5.4. Предимплантационные эмбрионы
Эмбрионы на стадиях дробления, используемые в экспериментах по
трансплантации ядер, могут быть получены либо вымыванием их из яйцевода
или матки, либо путем культивирования начиная с 1- или 2-клеточной стадии
in vitro (см. гл. 2, разд. 2).
3. Перенос ядер
3.1. Установка камеры
1. Укрепите на манипуляционной камере покровное стекло с помощью
небольшого количества смеси вазелин/парафин (~5%-ный густой парафин),
нанесенной шприцем на выступы камеры.
2. Под контролем наименьшего увеличения препаровального микроскопа
нанесите капли препарата вируса Сендай и среды PNC на нижнюю сторону
покровного стекла, воспользовавшись для этого оттянутой пастеровской
пипеткой. Сначала вблизи заднего выступа камеры поместите большую каплю
(полусфера диаметром около 3 мм) вирусной суспензии, затем примерно 12
маленьких капель (полусферы диаметром около 1,5 мм) среды PNC, расположив
их в ряд по центру камеры (рис. 12.4,А).
3. Осторожно заполните камеру до боковых граней покровного стекла тяжелым
жидким парафином с помощью укороченной пастеровской пипетки.
4. Введите оттянутой пастеровской пипеткой предназначенные для этого яйца
в капли. Во избежание путаницы полезно всегда следовать одному и тому же
порядку размещения яиц по каплям: например, в первые четыре капли,
ближайшие к капле Сендай, поместить донорские яйца
312
Глава 12
S
Рис. 12.4. А. Манипуляционная камера с каплями, нанесенными на нижнюю
поверхность покровного стекла. Б. Манипуляционная камера с инструментами,
приготовленными к введению в камеру, внд сбоку.
группами по четыре, следующую каплю оставить пустой, в нее можно
отсаживать поврежденные ядра и дебрис и, наконец, в оставшиеся капли
поместите парами яйца-реципиенты. При этом в инкубаторе уже должна быть
готова культуральная чашка с серией больших капель М16 + БСА под маслом
для приема оперированных яиц.
3.2. Установка инструментов
1. Поместите загруженную камеру на предметный столик микроскопа и
сфокусируйте объектив малого увеличения на яйце. Затем сдвиньте камеру к
задней границе столика. Плоскость фокусного расстояния находится чуть
выше дна операционных капель; с этого момента не прикасайтесь к
микрометрическому винту, пока не установите инструменты. Фокусирование
инструментов производится подъемом и опусканием Манипуляторов.
2. Установите оба манипулятора в положении, позволяющем перемещаться в
горизонтальной плоскости--оно соответствует отметке "О" на шкале (см. гл.
3, рис. 3.8, правый манипулятор).
3. Соедините удерживающую пипетку посредством трубки со шприцем Agla
(после того, как в системе не останется пузырьков воздуха), затем
закрепите трубку в инструментальной головке одного из манипуляторов
(обычно левого).
4. Расположите инструментальную головку так, чтобы удерживающая пипетка
