Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты - Лобанок А.Г.
ISBN 5-343-00283-8
Скачать (прямая ссылка):
Преимущество грибов Trichoderma как источников целлюлаз в том, что они продуцируют достаточно полный комплекс целлюлаз с очень большим выходом. К недостаткам следует отнести низкую удельную активность целлюлаз, незначительный уровень образования р-глюкозидазы и неспособность грибов атаковать лигнины (Mandels, 1984). Поэтому продолжаются поиски новых продуцентов целлюлаз.
Как деструктор лигнина (но не продуцент целлюлаз) продолжает вызывать интерес Sporotrichum pulverulentum (Ljungdahl, Eriksson, 1985). Целлюлаза Iгрех lacteus коммерчески производится в Японии. Активно используются целлюлазы из термофильных актиномицетов Streptomyces thermodiasticus, Thermomono-spora curvata и T. fusca, однако их целлюлолитические системы плохо действуют на нерастворимую целлюлозу. Культуральные
71
фильтраты этих организмов не содержат (3-глюкозидазу, которая связана с клеткой, а целлюлазный комплекс сильно ингибируется целлобиозой. Из-за высокотемпературного оптимума целлюлаз термофильных актиномицетов дополнение их целлюлазного комплекса (3-глюкозидазой грибов нецелесообразно. По-прежнс-му исследователи изучают бактериальные целлюлазы.
Сегодня лучшим продуцентом целлюлаз является Trichoderma reesei. На основе этого организма в разных странах получено множество перспективных мутантов. Работы, выполненные американскими исследователями с использованием этого организма, обобщены Mandels (1984). Гриб хорошо растет на синтетических средах, удельная скорость роста его на среде с глюкозой
0,12—0,24 г/(г-ч), оптимум pH 4,0, температуры — 35 °С. Выход биомассы 0,4—0,5 г/г глюкозы.
Ряд мутантов, полученных из Trichoderma reesei, имеет различия только количественного характера: мутанты продуцируют больше целлюлаз, чем исходный штамм, но состав, свойства целлюлазного комплекса одинаковы. Все штаммы Trichoderma reesei продуцируют малое количество конститутивной целлюлазы. Для достижения высокого уровня синтеза необходима индукция, синтез подвержен катаболитной репрессии. Получены мутанты с частично дерепрессированным синтезом, а также с повышенным уровнем конститутивного синтеза.
Принято считать, что фермент целесообразно получать на том же субстрате, на который он будет действовать. Это, по-видимому, справедливо для тех случаев, когда культуральная жидкость применяется непосредственно как источник целлюлазы. Если же фермент производится в больших количествах или для специальных целей, отказ от чистой целлюлозы, если она может увеличить выход фермента, выигрыша не дает.
Одна из проблем крупномасштабного получения целлюлазы — продолжительность ферментации при глубинном культивировании. В Японии целлюлазу получают с помощью поверхностного культивирования Trichoderma viride на отрубях. Этот процесс обеспечивает высокий выход целлюлаз, но весьма трудоемок. В последнее время метод поверхностного культивирования вновь привлекает внимание исследователей (Kim, 1985). Система твердофазной ферментации создает более естественные условия для микроорганизмов и в определенных условиях может достаточно эффективно применяться для получения продуктов ферментации.
Результаты экспериментов (Deschamps et al., 1985), которые проводились с Trichoderma harzianum, указывают на то, что цел-люлолитические ферменты можно подучать методом твердофазной ферментации в нестерильных условиях. Особенно эффективна твердофазная ферментация с перемешиванием. По мнению авторов, этот метод проще и дешевле: проще оборудование для культивирования, меньше сточных вод, ниже затраты на произ-
72
водство, так как процесс менее энергоемкий. Дорогостоящих этапов выделения и очистки ферментов можно избежать, так как обогащенный цсллюлазон субстрат после подсушивания при 40 °С может быть использован непосредственно для осахари-вания.
Показана возможность получения высокоактивных препаратов целлюлаз путем твердофазного культивирования мутантного штамма Trichoderma reesei на обработанных щелочью лигно-целлюлозных субстратах. В процессе ферментации гриб потребляет вначале гемицеллюлозную фракцию субстрата, а затем целлюлозу. Полученный таким образом целлюлазный комплекс эффективно гидролизует делигнифицированную пшеничную солому (Chahal, 1985).
В нашей лаборатории (Лобанок, 1977) впервые из молочной сыворотки были получены целлюлолитическис ферменты. Существенной особенностью сыворотки как питательной среды является наличие в ней лактозы, молочной кислоты, аминокислот, витаминов, фосфолипидов, стеринов и других физиологически активных веществ. На разведенной в 2 раза сыворотке с добавлением в нее 0,3% NaNOj и 0,05% MgS04 Trichoderma ligno-rum 534 продуцирует комплекс целлюлолитических ферментов, как и при культивировании его на среде со специфическим субстратом— целлюлозой. Интенсивный рост гриба на молочной сыворотке отмечается уже в первые сутки, а максимум целлюло-литической активности — на третьи-четвертые сутки. Одновременно с целлюлазой Trichoderma Ugnorum продуцирует целло-биазу, амилазу и |3-галактозидазу.
В опытах с мутантным штаммом Trichoderma reesei (Pourouie, Vandccasteele, 1985) установлено, что уровень образования целлюлаз на среде с лактозой и уровень их синтеза на чистой целлюлозе практически одинаковы. На среде с подпиткой активность синтеза целлюлаз возрастает более чем в три раза. Warzywoda et al. (1983) исследовали образование целлюлазы Trichoderma reesei на различных источниках углерода и также пришли к выводу, что молочная сыворотка может быть перспективной средой для получения целлюлаз в промышленном масштабе.
