Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты - Лобанок А.Г.
ISBN 5-343-00283-8
Скачать (прямая ссылка):
У мутанта Clostridium thermocellum, потерявшего способность образовывать компонент ЦСФ, ответственный за сцепление с клеткой, при росте на среде с целлюлозой происходит восстановление способности к образованию полноценного ЦСФ (Bayer et al., 1983).
Clostridium thermocellum JM 20 в процессе роста на среде с целлюлозой также продуцирует целлюлолитические ферменты,
32
которые на ранних стадиях ферментации связаны с субстратом. Ферменты выделяются в культуральную жидкость после потребления целлюлозы в виде трех основных комплексов, качественно схожих по содержанию 20 различных полипептидов, из которых около десяти являются основными компонентами (Hon-nami etal., 1986).
Условия роста (среда с целлюлозой или среда с целлобио-зой) критически влияют на распределение целлюлосом у мутантов Clostridium thermocellum (Bayer et al., 1985). У них (в противоположность диким типам) целлюлосомы на поверхности клеток отсутствуют, а незначительное образование внеклеточных целлюлосом сопровождается продуцированием других низкомолекулярных целлюлаз. Полипептидиый состав соответствующих очищенных целлюлосом у мутантов и диких типов Clostridium thermocellum сходен. У диких типов бактерий на клеточной поверхности выявлены полицеллюлосомные протуберанцы, которые отсутствуют у мутантов. Примечательным свойством целлюлосом является их стабильность. Предполагается, что организация множественных форм целлюлолитических ферментов (каждый из которых обладает сродством к субстрату) в большой комплекс способствует увеличению аффинитета всего комплекса к субстрату.
Связанная с поверхностью целлюлазная активность отмечена также у капсульных структур Ruminococcus albus (Stack, Hun-gate, 1984). Секреция фермента коррелирует с появлением больших везикул. У другой бактерии рубца — Bacteroides succinogenes (Groleau, Forsberg, 1981)—секретируемый фермент связан с мембранными фрагментами. Таким образом, прослеживается общая закономерность специализации ферментсодержащих поверхностных структур клетки анаэробных целлюлолитических бактерий, обеспечивающих адгезию клетки на субстрате и его гидролиз.
Целлюлолитическая система Clostridium thermocellum, связанная на целлюлозе в течение начальных стадий роста, была разделена на два комплекса, представляющих собой сферические частицы с ММ 4,2-106 и 102-106 (Coughlan et al., 1985). Предполагается, что целлюлолитическая система Clostridium thermocellum вначале функционирует в виде больших комплексов, при их диссоциации образуются комплексы, которые обнаруживаются в культуральной жидкости и, если не деградиру-ются, могут повторно связываться с целлюлозой.
При росте дикого штамма Clostridium thermocellum на среде с целлобиозой на поверхности клеток выявляются многочисленные полусферические выступы размером 130—200 нмХбО— 100 нм. Эти образования являются полицеллюлосомами, объединяющими несколько сотен целлюлосом. В процессе роста бактерий на целлюлозе происходит резкое изменение этих выступов с образованием аморфной или фиброзной сетчатой струк-
3. Зак. 966
33
туры, которая соединяет поверхности клетки и целлюлозы, образуя «контактный коридор». Однако за непосредственное связывание с клеткой ответственны целлюлосомы (Lamed, Bayer,
1986).
Ljimgdahl et al. (1983) обнаружили, что Clostridium thermo-cellum выделяет в культуральную жидкость желтое вещество (ММ 1500) с высоким сродством к целлюлозе, что приводит к ее окрашиванию. Конъюгат целлюлозы и желтого вещества имеет большее сродство к эндоглюканазе, чем одна целлюлоза. Также показано, что внеклеточная целлюлазная активность термофильного анаэроба Clostridium thermocellum зависит от наличия Са2+ и тиолвосстанавливающих агентов. Максимум активности целлюлаз из Clostridium наблюдается при 70 °С и pH 5,7—6,1. По-видимому, Clostridium thermocellum помимо эндо-глюканазы продуцирует также экзоглюканазу и целлобиогидро-лазу (Johnson et al., 1982).
При совместном культивировании бактерий Cellulomonas и Clostridium в анаэробных условиях расщепление целлюлозы происходит более интенсивно и с образованием большего количества сахаров, чем при выращивании чистых культур (Andria-narisoa et al., 1984). Таким образом, видно, что целлюлолити-ческие системы бактерий и грибов различны. Основное отличие — это высокая величина отношения эндоактивность— экзоактивность у бактерий по сравнению с грибами.
Принято считать, что термофильные целлюлолитические микроорганизмы являются потенциально более перспективными продуцентами целлюлаз. Один из них — Microbispora bispora—¦ продуцирует целлюлолитический комплекс, стабильный при 60— 65 °С, включает эндоглюканазу, целлобиогидролазу и р-глюко-зидазу. Последняя не выделяется в среду и связана с клеточной стенкой (Bartley et al., 1984). р-1,4-Эндоглюканаза Myceliophtho-ra thermophila по величине периода полуинактивации при 65° С (3 сут) в 200 раз превосходит эндоглюканазу из Trichoderma reesei (22 мин в тех же условиях) (Клесов и др., 1986). Однако высказываются и сомнения по этому поводу, например то, что оптимумы и максимумы температурной активности целлюлаз из термофильных грибов немногим выше, чем у целлюлаз мезо-фильных штаммов. Это неудивительно, так как целлюлазы ме-зофильных организмов способны выдерживать температуры, при которых растут термофильные грибы.
