Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты - Лобанок А.Г.
ISBN 5-343-00283-8
Скачать (прямая ссылка):
В течение ряда лет исследование механизма действия целлюлолитических ферментов шло медленно, так как не были известны микроорганизмы, продуцирующие внеклеточные ферментные комплексы, способные осахаривать такие высокоорганизованные формы целлюлозы, как хлопок.
Способность бесклеточных препаратов целлюлолитических ферментов расщеплять целлюлозу одним из первых продемонстрировал Halliwelt (1966). В его опытах отмечены три стадии
34
расщепления хлопка внеклеточной целлюлазой Trichoderma ko-tiingi: фрагментация хлопкового волокна, образование растворимых продуктов целлюлолизиса и, наконец, образование глюкозы. Причем образование коротких нитей и глюкозы происходит одновременно (Halliwell, 1966).
При инкубировании неочищенного препарата культуральной жидкости Trichoderma kotiingi с обезвощенным волокном хлопка при pH 5,0 Marsh (1957) также наблюдал выраженную фрагментацию. Образование коротких нитей происходило только при сильном встряхивании. Присутствие кислорода на фрагментацию не влияло. Она сопровождалась незначительным выделением растворимых сахаров. По мнению Marsh (1957), фрагментация нитей хлопка —¦ явление неспецифическое и обусловлено повышенной хрупкостью хлопкового волокна вследствие воздействия фермента и появления поперечных трещин.
Berg et al. (1972) с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии обнаружили разрушение целлюлозы бактериями Cellvibrio julvus и Sporocytophaga myxococcoides. В кристаллические участки микрофибриллы хлопка бактерии проникали с трудом, и его расщепление шло медленно. Фильтровальная бумага и целлюлозная пудра разрушались быстрее. Cellvibrio fulvus образовывала скопления между микрофибрил-ламн и разрушала целлюлозное волокно. Древесные волокна быстро разрушались бактериями обоих родов после удаления лигнина. Структура этих волокон не столь плотная, как у хлопка, поэтому бактерии легко проникали в полость волокна. Kjlber-tus et al. (1973) при электронномикроскопическом исследовании наблюдали, как на поверхности волокон целлюлозы под действием внеклеточной целлюлазы Trichoderma viride появлялись трещины и разрывы.
Предполагается зависимость между размерами поверхности субстрата и скоростью ферментативного гидролиза целлюлозы. При действии частично очищенной целлюлазы Trichoderma viride на кристаллическую гидроцеллюлозу King (1966) наряду с поверхностной эрозией субстрата зафиксировал фрагментацию субстрата, которая по образующимся фрагментам отличалась от фрагментации хлопкового волокна, наблюдаемой Halliwell (1966). Из микрокристаллических частиц гидроцеллюлозы диаметром 6 мкм в опытах King образовывалось до 1500 частиц меньшего размера.
Целлюлоза является высокоупорядоченным полимером, и ее способность к набуханию или растворению предопределяет гидролитическое действие целлюлазы. Такая подготовка субстрата может осуществляться в результате физико-химической обработки, действия солнечной радиации, а также иод влиянием малых количеств перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии солей железа в кислой среде вызывает каталитическое расщепление хлопка, травы, соломы, сена и опилок. Halliwell
з*
35
(1966) полагает, что таким может быть альтернативный, или дополнительный, наряду с гидролитическим действием целлюлазы механизм дезинтеграции целлюлозы. Микроорганизмы, обладающие способностью образовывать перекись водорода, благодаря наличию глюкозооксидазы осуществляют локализованную атаку на природную целлюлозу. Подобного рода реакции имеют большое значение при действии некоторых дереворазрушающих грибов, например Sporotrichum pulverulentum (Eriksson et al., 1974). Аналогичные окислительные ферменты выявлены и у других микроорганизмов, разлагающих целлюлозу: Poly рог us adust us, Myrothecium verrucaria, Trichoderma viride.
Для фрагментации нитей хлопка под действием культуральной жидкости Trichoderma reesei требуется также присутствие кислорода (Vaheri, 1982). Предполагается, что в начальной стадии расщепления хлопка окислительные реакции вызывают изменения в целлюлозе, которые хотя и не приводят к образованию растворимых продуктов, но повышают чувствительность субстрата к эндо-|3-глюканазе. Выявлено, что в процессе расщепления целлюлозы ферментами Trichoderma reesei образуются альдоновые кислоты, продукты окисления углеводов. В отсутствие кислорода не происходит фрагментации хлопка на короткие нити. Видимо, в ранних стадиях деградации целлюлозы определенную роль играют окислительные процессы. При индукции целлюлаз окислительные ферменты обнаруживаются в среде культивирования, тогда как у неиндуцированной культуры окислительные ферменты связаны с клетками. Так как эти ферменты обнаруживаются у гриба, выращенного на среде с глицерином, предполагается различная регуляция образования целлюлаз и окислительных ферментов (Vaheri, 1985).
Важным фактором, определяющим расщепление высокоорганизованных субстратов, таких, как, например, хлопок, является их надмолекулярная структура. Еще в 1961 г. Selby (1961) отмечал, что по сравнению с кислотным гидролизом действие целлюлаз на хлопок при одинаковом образовании редуцирующих групп в нерастворимом остатке сопровождается большими потерями массы субстрата. Воздействие ферментов имеет более сильный эрозирующий эффект.
