Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты - Лобанок А.Г.
ISBN 5-343-00283-8
Скачать (прямая ссылка):
Методом малоуглового рентгеновского рассеяния установлено, что молекула целлобиогидролазы Trichoderma reesei имеет форму клина с изотропной головкой и длинным хвостом (Schmuck et al., 1986). Grethlein (1985) удалось установить корреляцию между начальной скоростью гидролиза и количеством пор целлюлозного субстрата, доступных по размерам для молекул целлюлаз. Показано, что субстраты, имеющие больше пор, чувствительнее к действию целлюлаз. В то же время не выявлено зависимости между степенью кристалличности и скоростью гидролиза.
Получены также данные о том, что лимитирующие скорость
36
гидролиза целлюлозы компоненты бактериальных и грибных целлюлазных комплексов одинаковы по размеру. Последний значительно меньше максимального размера пор в нативных целлюлозных субстратах (Weimer, Weston, 1985).
Микроорганизмы, расщепляющие природную целлюлозу, обитают или на поверхности целлюлозного, например хлопкового, волокна, или во внутреннем его отверстии, например у древесины. Внеклеточные целлюлолитические ферменты могут быть связаны на поверхности микробной клетки, и тогда необходим непосредственный контакт микроорганизма с субстратом. Если целлюлазы выделяются в окружающую среду, то они проникают в тонкие клеточные структуры и воздействуют на микрофибрил-лярную и тонкую капиллярную или молекулярную структуры иолокна. Микроскопическая картина повреждения целлюлозных структур целлюлолитическими ферментами весьма специфична для определенных групп микроорганизмов (Cowling, Brown, 1969).
Для того чтобы целлюлозные микрофибриллы с очень сложной структурной организацией деполимеризовались целлюлаза-ми до образования растворимых легкоусвояемых продуктов, необходимы условия, обеспечивающие диффузию ферментов в структурный матрикс целлюлозы, и возникновение комплекса фермент—субстрат. Целлюлаза должна не только проникнуть в целлюлозную структуру, но, чтобы расщепить определенные р-гликозидные связи, прийти в стерическое соответствие с субстратом. При воздействии на целлюлозу в отличие от других типов ферментативных реакций, протекающих в растворе, действие фермента осуществляется на разделе фаз раствора фермента и нерастворимой поверхности субстрата.
Полагают, что на скорость ферментативного гидролиза влияет величина реакционной поверхности субстрата (Fan et al., 1981). Так, отмечена определенная зависимость между начальной скоростью ферментативной реакции и поверхностью целлюлозных гелей, доступных молекулам целлюлаз (Stone et al., 1969). Сложность и гетерогенность лигноцеллюлозных субстратов требуют последовательного воздействия на них весьма большого количества ферментов. Поэтому химический состав и физические особенности субстратов, ограниченные возможности одного микроорганизма продуцировать весь необходимый набор ферментов определяют устойчивость целлюлозной микрофибриллы к воздействию ферментов данного микроорганизма.
Пот, влиянием целлюлолитических ферментов природная целлюлоза изменяет свои физические свойства еще до появления редуцирующих сахаров. Это выражается в появлении поперечных трещин и потере прочности, снижении степени полимеризации, повышенной адсорбции влаги и щелочи и, наконец, во фрагментации целлюлозного волокна. Подробно факторы, определяющие чувствительность целлюлозных структур к фермента-
37
тивному гидролизу (содержание влаги, форма и диффузионные свойства молекул фермента, размеры и свойства поверхности капилляров, пространства между микрофибриллами и макромолекулами целлюлозы в аморфных участках, степень кристалличности и полимеризации целлюлозы, конформация и стерическая ригидность ангидроглюкозных единиц и др.), рассматриваются в обзоре Cowling и Brown (1969).
К целлюлолитическим относят ферменты, которые расщепляют р-1,4-гликозидные связи целлюлозы между остатками D-глюкозы целлюлозы и ее растворимых производных. Наиболее распространенная целлюлаза — эндоглюканаза, или р-1,4-D-глюканглюканогидролаза, способная гидролизовать любую гли-козидную связь в молекуле целлюлозы. Однако при высокой степени полимеризации субстрата вероятность атаки эндоглюкана-зой внутренних его связей значительно выше, чем крайних. Поэтому в результате такого неупорядоченного действия образуются фрагменты молекулы целлюлозы различной длины (Рабинович,
1987).
Так как эндоглюканазы расщепляют целлюлозные цепи посередине, образуются в значительном количестве невосстанавли-вающиеся концы. От последних целлобиогидролазы и глюкогид-ролазы отщепляют целлобиозу и глюкозу. Целлобиаза, которую не всегда считают целлюлазой, гидролизует целлобиозу до глюкозы. В деградации упорядоченных форм целлюлозы могут принимать участие окислительно-восстановительные ферменты—-целлобиозооксидаза и целлобиозохиноноксиредуктаза, которые окисляют целлобиозу и целлоолигосахариды до целлобиозолак-тона или до целлобионовой кислоты. Целлюлолитические ферменты при очень высоких концентрациях конечных продуктов в системе могут катализировать реакцию синтеза р-1,4-гликозид-ной связи, а также реакцию трансгликозилирования, в результате чего к примежуточному фермент-субстратному соединению присоединяется дополнительная молекула субстрата, при этом тип связи изменяется с р-1,4 на р-1,6 или р-1,2. Эти реакции осуществляются в основном эндоглюканазами и целлобиазой и, как полагают, играют определенную роль в образовании индуктора синтеза целлюлаз (Рабинович, 1987).
