Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты - Лобанок А.Г.
ISBN 5-343-00283-8
Скачать (прямая ссылка):
В экспериментах Macris et al. (1985) значительное количество целлюлазы и р-глюкозидазы, способных осахаривать хлопковое волокно и целлюлозу пшеничной соломы, секретировались мутантами Aspergillus ustus и Trichoderma harzianum на среде с целлюлозными материалами, в том числе на соломе. При смешивании культуральных жидкостей отмечался выраженный синергизм при действии на хлопковое волокно.
Szakacs-Dobozi et al. (1985) сравнили по эффективности гидролиза очищенной целлюлозы и целлюлозосодержащих отходов супернатанты культуральных жидкостей шести целлюлолитиче-
42
ских грибов и их смешанных ферментных систем. Оказалось, что скорость гидролиза целлюлозы увеличивается в случае, когда целлюлазные комплексы Trichoderma, Aspergillus или Penicilliuni действуют совместно.
По данным Клесова и Рабиновича (1978), добавление целло-биазы к ферментным препаратам, лимитированным по этому ферменту, приводит к ускорению ферментативного гидролиза и увеличению выхода конечного продукта — глюкозы. Однако, учитывая степень гидролиза фильтровальной бумаги внеклеточными препаратами целлюлаз Trichoderma reesei и его мутантов с пониженным уровнем р-глюкозидазы и повышенным уровнем эн-доглюканазы, Chaudhary et al. (1985) сделали вывод о том, что способность расщепления целлюлозы лимитируется содержанием эндоглюканазы, а не р-глюкозидазы. В литературе большинство авторов отмечают особое значение синергизма между отдельными компонентами целлюлазного комплекса. По мнению же Клесова и Рабиновича (1978), речь идет не о подлинном, а о кажущемся синергизме, когда один фермент поставляет субстрат для другого, а он в свою очередь снимает ингибирующее действие продукта на предыдущий фермент в цепи.
Enari, Niku-Paavola (1987) полагают, что гидролиз нативной целлюлозы осуществляется в результате синергического действия целлобиогидролаз I и II. При гидролизе хлопка целлобиогидро-лаза I фрагментирует его и образует растворимые сахара, при действии на кристаллическую целлюлозу образуется целлобиоза. Для этого фермента предлагается название р-1,4-глюканцелло-биогндролаза. Целлобиогидролаза II по механизму действия сходна с экзоферментами, однако не во всем, иммунологически она вполне индивидуальна. Эндоглюканазы участвуют в более поздних стадиях гидролиза, когда гидролизуются растворимые декстрины, следовательно, эндоглюканазы сопоставимы с |3-глю-козидазой, которая атакует только целлобиозу.
По современным представлениям, гидролиз нативной целлюлозы является результатом синергического действия эндо- и экзо-глюканаз, которые либо образуют мультиэнзимный комплекс на поверхности молекулы субстрата, либо действуют последовательно-параллельно.
Трудности выяснения механизма ферментативного гидролиза целлюлозы связаны с комплексом свойств белков целлюлолитических ферментов н сложностью анализа различных нерастворимых продуктов гидролиза целлюлозы. Результаты экспериментов с использованием различных производных целлюлозы, в том числе низкомолекулярных соединений, необязательно справедливы для нерастворимой целлюлозы. Целлюлолитические ферменты, полученные в разных условиях культивирования, выделения и хранения и подвергнутые различным процедурам очистки, проявляют неодинаковые свойства. Сравнить активность ферментов можно только при использовании идентичных субстратов. Чем
43
дольше гидролиз, тем лучше проявляется эффект всех ферментов, присутствующих в целлюлолитическом комплексе. Оценка специфичности целлнеполитических ферментов в целом затруднена из-за отсутствия специфических субстратов и стандартизации методов определения активности. Имеющиеся данные позволяют полагать, что множественные компоненты отдельных целлюлаз не являются истинными изоферментами.
Прогресс, достигнутый за последнее десятилетие в области изучения механизма ферментативного расщепления целлюлозы, очевиден. Установлено, что целлюлолитические ферменты, входящие в состав целлюлазных комплексов, характеризуются субстратной специфичностью, определенными кинетическими параметрами, изотермами адсорбции на водно-растворимых производных целлюлозы, термостабильностью, их активность и адсорбционная способность зависят от pH, температуры и величины рК ионогенных групп активного центра.
Концепция о том, что Сгфермент является экзо-р- 1,4-глюка-назой, не подтверждается. Сам автор гипотезы (цит. по Mandels, 1984) пришел к мнению, что гипотетический Сгфермент может быть эндо-р-глюканазои очень неупорядоченного действия. Во всяком случае этот фермент никогда не был выделен и его активность не была определена сколько-нибудь рациональным способом. Лимитирующий фактор всех известных целлюлазных комплексов — их низкая удельная активность. Проблема окончательного выяснения механизмов многоступенчатого расщепления природной целлюлозы с учетом ее надмолекулярной структуры и реальных субстратов пока не решена.
Существенным недостатком исследований свойств целлю-лолитических ферментов и механизма их действия является то, что они проводятся без учета условий их получения, особенно условий культивирования микроорганизмов-продуцентов. Применение сред различного состава, поверхностного и глубинного культивирования, неодинаковые условия и сроки культивирования даже в случае использования одного и того же продуцента приводят к гетерогенности состава и свойств иеллюлазного комплекса, первично связанных с условиями биосинтеза и реализации генетической информации и вторично — с модификацией компонентов в среде культивирования. Помимо Trichoderma reesei, гетерогенность и модификация ферментов отмечены и для ряда других целлюлолитических микроорганизмов
