Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
2. Чашку Петри трижды промывают ЗФР, добавляют 6 мл этого буфера, содержащего 5% СПК (ЗФР-5% СПК), и инкубируют при комнатной температуре 15 мин или дольше.
3. Готовят суспензию отдельных лимфоидных клеток в концентрации 1-107 клеток/мл в ЗФР, содержащем 1%' СПК (ЗФР-1% СПК).
4. Удаляют из чашки Петри ЗФР-5% СПК и добавляют туда 6 мл клеточной суспензии (6-107 клеток на чашку Петри).
5. Чашки Петри инкубируют 25 мин при 4°С. Прилипание клеток контролируют в фазово-контрастном микроскопе, осторожно перемешивают содержимое чашек вращательным движением и инкубируют при 4 °С еще 25 мин.
6. Не прилипшие к чашке клетки удаляют, перемешивая содержимое чашек осторожными вращательными движениями.
Овца как экспериментальная модель
461
Чашки четыре раза промывают ЗФР и неприлипшие клетки собирают вместе.
7. Чашки промывают еще два раза и смыв выливают. Добавляют в чашки по 6 мл ЗФР-1% СПК и снимают прилипшие клетки (содержащие поверхностные иммуноглобулины) сильной струей этого же раствора из пипетки. При работе с лимфоцитами из лимфы эфферентного лимфатического протока 90— 95% неприлипших клеток составляют Т-клетки, а менее 5% — В-клетки. Более 90% прилипших клеток несут поверхностные иммуноглобулины.
Б. Криоконсервация лимфоцитов
При замораживании лимфоцитов овцы с использованием соответствующего программируемого прибора для замораживания клеток они сохраняют свои исходные свойства и могут быть использованы в различных тестах in vitro (Miyasaka, McCullagh, 1981, 1982a, b).
1. Замораживание лимфоцитов
1. Суспензию клеток готовят в модифицированной Дульбекко минимальной среде Игла (МСИД), содержащей 20% СПК и 10% диметилсульфоксида (ДМСО).
2. Клеточную суспензию разливают порциями по 2 мл в стерильные пластмассовые пробирки с завинчивающимися крышками (Sterilin, Англия) и инкубируют пробирки при 4°С 5— 10 мин.
3. Клетки замораживают в замораживателе с контролируемой скоростью охлаждения, которая должна составлять — 1 °С/мин в диапазоне от 4 до—40°С, и —5 °С/мин в диапазоне от —40 до—120 °С, а затем переносят пробирки в жидкий азот. Мы используем аппарат Minicool (Compagnie Fran^aise de Рго-duits Oxygenes, Франция).
2. Размораживание хранящихся
при низкой температуре лимфоцитов
1. Клетки быстро размораживают, встряхивая пробирки в теплой воде (45—50 °С). Встряхивание прекращают в тот момент, когда кристаллы льда в пробирке достигают размера примерно 3—4 мм, после чего оттаивание продолжают, держа пробирку в ладони.
2. Содержимое пробирки переносят в градуированную пробирку.
462 Глава 24
3. Клеточную суспензию разводят для удаления ДМСО. Пипеткой на 5 мл в пробирку добавляют 2 капли среды МСИД, содержащий 10% СПК (среда для разведения), и каждую минуту добавление повторяют, увеличивая дозу среды на одну каплю до тех пор, пока объем жидкости в пробирке не станет равным
5 мл. Если среду добавляют к клеткам слишком быстро, многие из них теряют активность, вероятно, из-за резкого градиента концентрации ДМСО, возникающего между клетками и средой.
4. После 10—20 мин добавление среды для разведения продолжают, приливая по 1 мл/мин до тех пор, пока объем не достигнет 10 мл.
5. Суспензию центрифугируют 7 мин при 150 g при комнатной температуре и очень осторожно дважды промывают средой для разведения. Следует избегать интенсивного пипетирования клеток. При правильном размораживании более 90% клеток должны быть жизнеспособными по тесту с трипановым синим. При этом, как правило, сохраняется более 70% исходного числа клеток.
В. Функциональные тесты
1. Стимуляция лимфоцитов овцы митогенами
Фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (Кон-А) стимулируют деление Т-клеток овцы, в то время как липополиса-харид (ЛПС) и белок А селективно стимулируют В-клетки. Представляет интерес исследовать как дозовые кривые ответа, так и кинетику ответа для каждого митогена и клеток каждого типа.
1. Готовят свежую культуральную среду (полная среда МСИД, GIBCO, номер по каталогу 074-2100), в состав которой входят 3,75 г/л NaHC03; 10% (по объему) СПК; 10 мМ ГЭПЭС;
2 мМ L-глутамин; 1 мМ пируват натрия; 1% (по объему) 100Х раствор заменимых аминокислот (Flow Laboratories); 100 ед./мл пенициллина; 100 мкг/мл стрептомицина; 10-4 М
2-меркаптоэтанол.
2. Готовят стерильные суспензии лимфоидных клеток.
3. Ресуспендируют клетки в концентрации 2,5• 106 мл в полной среде МСИД и по 0,2 мл клеточной суспензии вносят в плоскодонные лунки панелей для микротитрования (Costar 3596). Контрольные и опытные культуры необходимо исследовать в тройных повторах.
4. Митогены разводят полной средой МСИД до концентрации, в 11 раз превышающей экспериментальную, и добавляют
Овца как экспериментальная модель
463
по 20 мкл разведенного митогена в лунку. В контрольные лунки добавляют по 20 мкл полной среды МСИД без митогена.
5. Культуры инкубируют при 37 °С в увлажненной атмосфере с 7,5% СОг в течение необходимого промежутка времени (обычно 3 дня).
