Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
![](/pic/spacer.gif)
![](/pic/spacer.gif)
6. Добавляют 1 мкКи 3Н-тимидина на лунку в объеме 20 мкл за 20 ч до сбора клеток.
7. Клетки собирают и переносят на фильтры с помощью автоматического харвестера (например, MASH II).
8. Высушивают полоски фильтров из харвестера, извлекают диски из полосок и помещают в сцинтилляционный флакон.
9. В каждый флакон добавляют 5 мл сцинтиллятора и измеряют радиоактивность в р-счетчике.
2. Смешанная культура лимфоцитов
1. Отвечающие на стимуляцию и стимулирующие клеточные популяции дважды промывают и ресуспендируют в концентрации 5 -106 клеток/мл в полной среде МСИД.
2. Перед помещением в культуру клетки-стимуляторы облучают (2000 Р).
3. Добавляют по 0,1 мл суспензии клеток каждого типа в 3 плоскодонных лунки(тройной повтор) панели для микротитрования и инкубируют их при 37 °С в увлажненном воздухе, содержащем 7,5% С02.
4. 3Н-Тимидин добавляют за 20 ч до сбора клеток.
5. Клетки собирают, переносят на фильтры с помощью харвестера и измеряют включение 3Н-тимидина, как описано в предыдущем разделе. Оптимальное время культивирования обычно составляет 5—7 дней, но для точного определения наиболее подходящих условий культивирования необходимо исследовать зависимость результатов от времени. При использовании в качестве отвечающих клеток лимфоцитов из эфферентной лимфы включение 3Н-тимидина должно составлять менее 1000 имп/мин в присутствии облученных аутологичных клеток и 20 000— 80 000 имп/мин в присутствии аллогенных клеток-стимуляторов.
3. Тестирование клеток
методом локального гемолиза
Для определения числа клеток, секретирующих специфические антитела, мы использовали метод локального гемолиза, предложенный Каннигэмом и описанный Лефковитсом и Касен-зой (Lefkovits, Cosenza, 1979). Для выявления всех клеток, секретирующих иммуноглобулины, мы использовали метод локального гемолиза эритроцитов, нагруженных белком А, де-
464 Глава 24
тально описанный Бернабе и др. (ВегпаЬё et al., 1981). В обоих случаях в качестве источника комплемента мы применяли сыворотку крови морских свинок. Сыворотку следует проверять на неспецифическую цитотоксическую активность по отношению к лимфоцитам овцы. Кроме того, ее адсорбируют используемыми для теста бараньими эритроцитами. Для тестов с эритроцитами, нагруженными белком А, мы использовали адсорбированную сыворотку морских свинок, которую предварительно пропускали через колонку с белком А, иммобилизованным на сефарозе. Удаление иммуноглобулинового компонента из сыворотки морской свинки приводит к увеличению размера зон гемолиза. Все проявляющие антитела (анти-Ig), используемые для тестов с эритроцитами, нагруженными белком А, следует тщательно адсорбировать бараньими эритроцитами.
Г. Иммуноцитохимия
1. Иммунофлуоресцентное
окрашивание одиночных клеток
а. Выявление поверхностных иммуноглобулинов
1. Клетки дважды промывают средой RPMI1640, содержащей 1% СПК (промывочная среда). Мы промываем клетки в пробирках (Beckman) на 1,5 мл центрифугированием при 333 g в течение 2 мин в центрифуге Microfuge 12 (Beckman).
2. 2—5-10® клеток инкубируют с 50 мкл конъюгированных с флуоресцеином (ФИТЦ) F(ab') 2-фрагментов кроличьих антител против иммуноглобулинов овцы при 4°С в течение 30 мин. Мы используем антитела фирмы Cappel (США).
3. Клетки дважды промывают и исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа Leitz Orthoplan с приставкой Ploemo-pak2 для флуоресценции в падающем свете или с использованием флуоресцентного сортера клеток.
б. Исследования поверхностных антигенов клеток с помощью моноклональных антител
1. Клетки дважды промывают промывочной средой.
2. Клетки инкубируют 30 мин во льду с 50 мкл соответствующим образом разведенных мышиных моноклональных антител и еще дважды промывают.
3. Клетки инкубируют 30 мин во льду с ФИТЦ-антимыши-ными иммуноглобулинами. ФИТЦ-конъюгированные F(ab')2-фрагменты козьих антител против иммуноглобулинов мыши
Овца как экспериментальная модель
465
Таблица 24-1. Моноклональные антитела против поверхностных антигенов лимфоцитов овец
Монокло Связывание с лимфоцитами или антигенами
нальные ан
титела
ST-1 Все тимоциты и периферические Т-клетки
T-80 >95% Т-клеток в лимфе
~ 60% Т-клеток в крови
18 Субпопуляция Т-клеток и клеток миелоидного ряда
197 Субпопуляция Т-клеток
92 Все В-клетки
175 Моноциты, миелоидные и эритроидные клетки
151 Все лейкоциты
(Cappel) практически не дают неспецифических реакций с клетками овцы и могут быть использованы в разведении 1: 100.
4. Клетки промывают и исследуют на флуоресценцию.
2. Иммунопероксидазное
окрашивание замороженных срезов
Мы применяем метод, описанный Ван Эвиком (van Ewijk,
![](/pic/spacer.gif)
![](/pic/spacer.gif)
![](./design/pic/spacer.gif)
![](/pic/wildcat.gif)