Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Прямое указание на наличие полидисперсности образца можно получить, сравнивая «кажущийся» коэффициент диффузии, вычисленный из результатов седиментационного опыта, с истинным коэффициентом диффузии. Совпадение этих величин свидетельствует об отсутствии полидисперсности. В противном случае величина «кажущегося» коэффициента диффузии будет больше истинного. При этом из-за различной скорости седиментации молекул с разными молекулярными весами происходит расширение границы. В случае сильной концентрационной зависимости коэф-
1 При определении DKaHt желательно применять двухсекториую ячейку для
dc
повышения точности определения ct и — . При использовании оптики Филь-
dx
dc
пота — Свенссона величина — пропорциональна максимальной ординате диа-
ах
граммы седиментации, а с — площади, ограниченной базовой линией и градиентной кривой. Коэффициентами пропорциональности являются факторы увеличения оптической системы (см. стр. 247).
в. Определение степени полидиснерсности
(25)
фициента седиментации наблюдается, напротив, сужение границы, обусловленное тем, что в переходной области с уменьшением концентрации и вязкости раствора происходит увеличение скорости седиментации отставших молекул. При исследовании границы концентрация анализируемого вещества в растворе должна быть достаточна мала, чтобы этим можно было пренебречь. Исследование формы границы в общем случае весьма сложно, поэтому ограничимся описанием одного из методов оценки полидисперсности. Предположим, что с0 — весовая концентрация вещества в растворе и что часть вещества dc0 обладает коэффициентом седиментации, лежащим в пределах от s до s + ds. Тогда функция g(s) распределения вещества по коэффициентам седиментации может быть найдена из опыта при помощи следующего выражения:
dc
g{s) = —-^l = — ( ~Х хш Ч, (26)
с0 ds с0 \ хм J
dc
где ——весовая доля вещества, обладающего коэффициентом с0
седиментации, лежащим в пределе от s до s + ds, равная g(s)ds\ х — расстояние от оси вращения до заданной точки на седимен-тационной кривой; хм — расстояние от оси вращения до мениска.
В формулу (26) входят величины, которые определяются из седиментационной диаграммы, но это выражение справедливо при отсутствии диффузии (или для вещества с очень малым коэффициентом диффузии). В том случае, когда расширение границы происходит как за счет диффузии, так и за счет полидисперсности, величину g(s) определяют для ряда моментов времени после начала седиментации. Расширение границы за счет полидисперсности прямо пропорционально длительности опыта t, так как каждая фракция движется со своей постоянной скоростью (20), вызывая размытие границы. Напротив, размытие границы за счет диффузии пропорционально Уt. Т. е. через достаточно большое время седиментации расширение границы вызвано в основном полидисперсностью, и, следовательно, экстраполяция функции g(s) к этому моменту времени исключает влияние диффузии. Полученное таким образом значение g(s) является функцией распределения образца по коэффициентам седиментации. Показано [38], что при условии to2sf< 1 для получения такого распределения необходима экстраполяция g(s) к нулевому зна-1
чению величины ______, где х — положение границы седиментации.
хЧ
На рис. 23 представлены данные Шумейкера и Шахмана [39] для распределений по коэффициентам седиментации g(s), полученных в различные моменты времени после начала седиментации (ДНК тимуса теленка). Полученные распределения совпа-
261
дают, что указывает на отсутствие вклада диффузии в расширение границы, которое, следовательно, связано только с полидисперсностью образца.
г. Седиментация в градиенте плотности
В последнее время широкое распространение получил метод седиментации в градиенте плотности [40]. Этим методом производятся очистка, выделение биополимеров и разделение компонент смеси биополимеров. Центрифугирование выполняется обычно с помощью, препаративных ультрацентрифуг в роторах с откидными стаканами. При этом осаждение молекул происходит в заранее созданном устойчивом градиенте плотности инертной среды; чаще всего для этой цели используют раствор сахарозы, обладающий значительной вязкостью. В дальнейшем под градиентом плотности мы будем подразумевать именно градиент плотности сахарозы, который создается изменением концентрации сахарозы по высоте пробирки, с наибольшей концентрацией у дна пробирки. Такое распределение концентрации обеспечивает устойчивость градиента плотности, а следовательно, и вязкости, вследствие чего граница седиментации также является устойчивой. После окончания центрифугирования и при манипуляциях с пробиркой при анализе полученная граница не искажается.
Распределение концентрации по высоте пробирки, как правило, линейно, но может быть и экспоненциальным, S-образным. Формирование градиента в пробирке производится специальным устройством, схема которого приведена на рис. 24. Устройство состоит из двух шприцев, соединенных общей выводной трубкой. Один из шприцев заполняется концентрированным раствором сахарозы в соответствующем буферном растворителе, другой — чистым растворителем. Перемешивание растворов происходит в выводной трубке. При постоянной скорости движения поршней концентрация сахарозы в растворе, вытекающем из устройства, изменяется линейно со временем. Соответственно в пробирке4 образуется линейное распределение плотности сахарозы по высоте пробирки. Для получения других форм распределения плотности по высоте скорости движения поршней изменяются по любому заданному закону при помощи кулачков различной формы. Усло-
