Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Для вывода уравнения, описывающего равновесное распределение вещества по кювете, воспользуемся схематическим изображением кювета (рис. 26), имеющей высоту h и уголь сектора Ф, вращающейся с угловой скоростью со. Поток вещества за единицу времени через любое сечение кюветы, расположенное на расстоянии х от оси вращения и имеющее, следовательно, площадь хФН, равняется:
—— =1 сФ xh—= сФ x2hs<d2, dt dt
dx
где 5 — константа седиментации; — ¦—скорость седиментации
dt
вещества; с — концентрация.
С другой стороны, встречный диффузионный поток в соответствии с первым законом Фика (23) равен
dmn _ dc
—^ = _Ф xhD —.
dt dx
Исходя из условия седиментационного равновесия
D 0)2Л" с
Исключая из выражения (28) величину ^ при помощи уравнения (19), получаем второе уравнение Сведберга:
dc
(29)
которое также дает абсолютный способ определения молекулярного веса.
Расстояние от мениска, см Расстояние от оси вращения, см
Рис. 27. Распределение концентрации с (А) и производной концентрации dc/dx (Б) в кювете при седиментационном равновесии
На рис. 27 приведено характерное распределение концентрации исследуемого вещества. Кривые 1—4 соответствуют начальным стадиям установления равновесия, кривая 5 — установившемуся равновесию.
Как уже указывалось, единственным недостатком этого метода является большое время установления равновесия, достигающее иногда нескольких суток.
Это время можно значительно сократить уменьшением высоты слоя в кювете до 1—2 мм, используя ячейки специальной конструкции [44]. При этом время установления седиментационного равновесия белков и полипептидов уменьшается до нескольких десятков минут.
Метод седиментационного равновесия позволяет также судить о полидисперсности исследуемого вещества [5], но на этом останавливаться здесь не будем.
В настоящее время для определения молекулярных весов гораздо чаще применяется метод приближения к равновесию, или метод Арчибальда [28]. Этот метод для проведения опыта требует существенно меньше времени, достаточно точен, требует малого количества вещества и также позволяет оценить степень гомогенности препарата. Исследуя условия движения вещества в центробежном поле, Арчибальд воспользовался следующим граничным условием для раствора в кювете: поток вещества через мениск и дно ячейки равны нулю. Это условие выполняется независимо от того, достигнуто или нет равновесное распределение. Следовательно, согласно уравнению (28), имеем
= = (зо)
^м \ ^ м сд ' ^ - д ^
Индекс м относится к условиям у мениска, индекс д — к условиям у дна.
Аналогично выводу уравнения (29), также используя выражение (19), получаем для мениска и дна соответственно
(-)
RT . \dx }м
Мм= 1 — VppM2 хмсм
(31а)
Мг =-------------------d_?_h '
(1— vpp) СО2 Хдсд
Если вещество гомогенно, то Мм = Мд\ неравенство этих величин свидетельствует о наличии полидисперсности образца. На рис. 28 приведено распределение концентрации и градиента концентрации в кювете в начальных стадиях установления равновесия. Если в качестве регистрирующей системы применяется оптика
Фильпота — Свенссона, производную — можно определить непосредг
dx
ственно из снимка. Она равна ординате у дна и мениска, отсчиты-
dc
ваемой от продолжения базовой линии, где — = 0. Концентрация в
dx
этих точках определяется графически из седиментационной диаграммы по формулам
'М — С0
1 С о ( dc
\ * Is)dx-
х\ J V dx
а Хд
dc
Здесь X — координата точки, где — == 0; хм и Хд — координаты
dx
мениска и дна (соответственно).
Начальная концентрация может быть легко определена из параллельного опыта с искусственной границей. Для этого на исследуемый раствор наслаивается растворитель. Спустя некоторое время регистрируют размытую границу между раствором и
растворителем (рис. 29), изображенную на седимен- ' тационной диаграмме в виде пика, площадь которого с
йс
dx
-Плато-
А
