Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
б. Метод скорости седиментации
Метод скорости седиментации и его разновидности широко применяются как для исследования свойств 'макромолекул в растворе, так и для разделения веществ. Основной измеряемой величиной в этом методе является коэффициент седиментации, который зависит от формы макромолекулы в данном растворе и от молекулярного веса.
Движение макромолекулы в центробежном поле происходит под действием ряда сил. На нее действует,' с одной стороны, центробежная сила VpmgPx, где V---объем молекулы; рм — ее плотность; со — угловая скорость ротора1; х — расстояние до осн вращения. С другой стороны, на иее действует архимедова сила выталкивания из раствора, которая равна VppaPx, где рр — плотность растворителя. Таким образом, результирующая этих двух сил равиа V (рм—9р)^х-
1 о = —, где п — число оборотов ротора в мин.
В расчете на I моль эта сила равна NaV (рм — рР) <о2х, где Na — число Авогадро1.
В центробежном поле частицы движутся со скоростью ~, при
этом результирующая сила NaV (Рл/ — рР) ®2х уравновешивается си-
dx
лой поступательного трения / — , где f — молярный коэффициент
dt
трения:
NAVpM(l-Vpp)tfx = f 4- (16а)
dt
где V — удельный парциальный объем молекулы, равный обратной величине плотности молекулы.
Так как произведение Na V рм равно молекулярному весу М, получаем
М(1-Урр)®2д; = / (166)
Для разбавленных растворов коэффициент трения f связан с коэффициентом диффузии D соотношением Эйнштейна:
(17)
ЭРВ
где R — газовая постоянная (8,314 - 107----------------), Т—абсолют-
моль • град
ная температура (в °К); D—коэффициент диффузии (в см2/сек).
Комбинируя выражения (17) и (166), получаем первую формулу Оведберга для определения молекулярного веса:
М{\ — Fp„) (о2,г= — ¦— (18)
V " D dt
ИЛИ
dx 1
RT
М =______—____^—- , (19)
(l-Vpp)D (1 — Vpp D
где s— коэффициент седиментации. При выводе этой Фопмулы не делалось никаких предположений о форме молекулы 2, поэтому такой метод определения молекулярного веса является абсолютным наряду с методами светорассеяния и осмотического
1 В центробежном поле частица может не только осаждаться, но и двигаться против поля, т. е. всплывать, если плотность растворителя больше плотности молекулы.
2 В неявном виде зависимость коэффициента седиментации от формы вхо-
дит в коэффициент трения f или коэффициент диффузии D.
давления. Коэффициент диффузии D определяется независимым способом; при некоторых условиях, однако, его можно определить и из. седиментационного опыта.
¦ Рассмотрим последовательно все параметры, входящие в уравнение (19).
Коэффициент седиментации, как уже указывалось (вьграже-
dx
ние (19)),— отношение скорости седиментирующей границы — к центробежному ускорению а>2х:
dx
dt
(О2*
(20)
Это выражение может быть записано по-иному:
1 d In х /rirv s
s = — ——-. (20a)
со2 dt
¦ ¦ см. г
Размерность коэффициента седиментации —•— или сек.
сек дин
Единицей коэффициента седиментации является сведберг (1 св = 10^13 сек).
Рис. 21. Схема, объясняющая эффект радиального разбавления
При-измерении коэффициента седиментации фиксируется положение седиментационной границы в определенные моменты времени. Так как граница седиментирующего вещества имеет конечную ширину, в качестве границы должна приниматься точка, концентрация в которой составляет половину величины концентрации на плато [26, 34]. Концентрация раствора с< в области плато со временем уменьшается (см. рис. 20). Этот эффект, носящий название радиального разбавления, связан с сек-ториальной формой ячейки и линейным увеличением центробежного -яоля с расстоянием.
Рассмотрим малый элемент объема dVi = h(pxdx (рис. 21), занятого раствором (h — постоянная толщина кюветы в направлении, перпендикулярном плоскости чертежа) в момент времени t. В следующий момент t + dt молекулы’ займут другой объем — dV2, который по сравнению с начальным несколько расширяется по радиусу за счет увеличения скорости молекул вследствие неоднородности центробежного поля (см. уравнение (166)), а дуги этого эле-
