Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
градиента. Тем не менее в сочетании с методом скоростной седиментации этот метод позволяет получать высокообогащенные популяции жизнеспособных клеток. Так, из популяции кроветворных клеток можно выделить 80—100% эритропоэти-ческих стволовых клеток и разделить их путем центрифугирования в градиенте Перколла [6] на клетки, находящиеся в S-фазе и остальные.
Разделение клеток с помощью скоростного центрифугирования проводится как на основе плавучей плотности клеток, так и их диаметра. Седиментация в поле силы тяжести является удобным и технически простым методом, и существенным преимуществом этого метода является возможность использования недорогого оборудования, такого как аппараты Стапут [8] или камера ЦелСеп [9] (Du Pont Ltd).
Аппараты могут быть использованы для нанесения ограниченного количества клеток (максимум 108 клеток) на поверхность градиента сыворотки, 'бычьего сывороточного альбумина или фиколла. При большом количестве клеток создаются проблемы на границе раздела градиента и образца, где клетки «проваливаются» в градиент. Этого можно избежать, если создавать промежуточный слой между клетками и градиентом. Главным недостатком седиментации в поле силы тяжести является длительность разделения.
Седиментация в изокинетическом градиенте (например, Фиколл в среде культуры ткани) также обеспечивает возможность удобного разделения клеток в стерильных условиях с использованием стандартного и доступного оборудования. Как и центрифугирование в поле силы тяжести, этот метод применим к разделению малого числа клеток.
Теория элютриационного центрифугирования обсуждается в работе Сэндерсона с сотрудниками [10]. При низкой силе тяжести эта система позволяет разделять за очень короткий промежуток времени до 10а клеток. В течение всей процедуры клетки могут быть суспендированы в привычной для них ростовой среде в стерильных условиях. При этом отпадает необходимость осаждать их перед загрузкой в ротор; что в свою очередь позволяет избежать травмирования клеток и увеличивает их жизнеспособность. Метод требует больше мастерства и более дорогого оборудования по сравнению с другими седиментаци-оннымк методами. Некоторые проблемы возникают из-за гидродинамических сил сдвига, хотя нежелательные эффекты частично пропадают при элютриации в присутствии сыворотки. Реагрегация клеток является проблемой при большинстве методов скоростной седиментации, особенно при работе с клеточными суспензиями из дезагрегированных тканей, по сравнению с разделением клеток постоянных клеточных линий. При элю-триационном центрифугировании образование клеточных агре-
гатов нарушает ток элютриационного буфера. Тем не менее элютриационное центрифугирование в качестве системы с высоким разрешением обеспечивает получение синхронизированной популяции минимально травмированных клеток.
Чрезвычайно эффективной альтернативой седиментацион-ным методам разделения клеток является электронная сортировка клеток, меченных моноклональными антителами к поверхностным маркерам [гл. 6]. В качестве примера можно привести исследования Ватта с сотрудниками [11], описавших дифференциальное связывание двух моноклональных антител с кроветворными клетками. При последовательной обработке этими антителами удалось выделить с помощью проточной цитометрии популяцию клеток, на 60% обогащенную эритроид-ными предшественниками. Этот метод обеспечивает получение небольшого количества клеток за короткий промежуток времени по сравнению с методом элютриации. Аппаратура для сортировки клеток требует больших материальных затрат как при приобретении, так и при эксплуатации.
3. Элютриатор
В 1973 г. фирма Beckman выпустила элютриаторный ротор JE-6, и к 1980 г. эта модель была доведена до современного ротора JE-6B, устанавливаемого в стандартную центрифугу J2-21.
Полный аппарат для непрерывной проточной элютриации включает в себя ротор JE-6B, содержащий элютриаторную камеру, насос и дополнительное оборудование для загрузки/элю-триации образцов клеток или для сбора вымываемых фракций.
3.1. Элютриаторный ротор
Элютриаторный ротор состоит из следующих основных частей.
I. Черный анодированный алюминиевый корпус, содержащий центральную колонну из нержавеющей стали с ап-ретурами входа и выхода.
II. Камера разделения и противобалансированная обходная камера, соединенные непосредственно с центральной колонной.
III. Вращающееся пластиковое уплотнение, обеспечивающее непрерывные вход и выход образцов и вымывающей жидкости в разделительную камеру без остановки вращения ротора.
Ротор в собранном виде со стационарными входным и выходным соединениями, установленными на вращающимся уплот-
Рис. 5.1. Элютриаторный ротор. Показаны вход (А) и выход (Б) клеток, вращающееся уплотнение (В) и окно (Г) для наблюдения элютриационной камеры и ее содержимого с помощью стробоскопического источника света.
Рис. 5.2. Стандартная элютриационная камера (А) и камера Сэндерсона (Б)
нением, показан на рис. 5.1. Окна в верхней; и нижней частях корпуса обеспечивают наблюдение за внутренней частью камеры и ее содержимым.
