Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Для проведения фокусировки могут быть использованы агарозные гели в специальных аппаратах для электрофореза (например, Pharmacia РЪЕ 3000 с источником питания ECPS 3000/’ /150).
I. Добавьте 1,25 мл амфолитов (2,5%), имеющих pH 3,5—
9,5, к 20 мл расплавленной агарозы при 56 °С и осторожно перемешайте.
II. Распределите раствор агарозы равномерно по поверхности поддерживающей гель гидрофобной пленки (110Х Х125 мм) прогретой пипеткой на 25 мл и отцентрируйте, используя формовочный спейсер.
III. Дайте агарозе затвердеть, уберите спейсер и оставьте гель во влажной камере при 4°С на 1 ч. Рекомендации по приготовлению и установке гелевых пластин можно найти в проспектах фирм — изготовителей приборов для ИЭФ.
IV. Поместите трафарет с сеткой на столик прибора, используя в качестве изолятора керосин. Удалите пузырьки воздуха и включите циркуляцию воды, охлаждающей столик (5—10 °С).
Y. Тщательно удалите капли конденсата с пластины геля, используя для этой цели фильтровальную бумагу, и поместите гель на трафарет с сеткой.
YI. Вырежьте электродные полоски бумаги длиной 85 мм, намочите каждую в соответствующем электролите и наложите на гель, тщательно соблюдая параллельность на расстояниях 5 мм от анодного и катодного концов.
VII. Установите на гель трафарет с прорезями на расстоянии 25 мм от катода и нанесите в прорези растворы стандартов (10 мкл) и исследуемые растворы (15 мкл, содержащие не менее 25 мкг белка). Крайние прорези оставьте пустыми во избежание краевых эффектов.
"VIII. Установите крышку с электродами, контролируя равномерность их контакта с электродными полосками бумаги. Подключите источник питания постоянной мощности с напряжением 3000 В и током 150 мА.
ЗХ. Через 25 мин отключите питание, удалите остаточную жидкость образцов, конденсат и накладной трафарет и продолжите разделение в течение еще 60 мин. В течение всего периода при необходимости отсасывайте образующийся конденсат.
После окончания ИЭФ отключите источник питания и проведите отбор образцов гелевой пластинки, фиксацию, окраши-
зание и промывку в следующей последовательности.
I. Тщательно промокните гель и вырежьте 16 маленьких дисков вдоль анодно-катодного градиента. Поместите диски в пронумерованные пробирки, содержащие по 1 мл
0,01 М КС1.
31. Поместите гель в плоский контейнер, добавьте на 10 мин фиксирующий раствор и трижды промойте бидистиллиро-ванной водой.
III. Тщательно смешайте содержимое пробирок, полученных
на этапе (I), и определите значение pH в течение 4—24 ч.
IV. Поместите на поверхность геля фильтровальную бумагу и, перевернув всю конструкцию, уложите ее на несколько слоев бумажных салфеток. На поддерживающую пленку положите небольшой груз.
Рис. 4.11. Результаты изоэлектрнческого фокусирования четырех линий гибридом. Каждый образец в концентрации 1—1,5 мг/мл наносился на 2 дорожки. Дорожки 1 и 2: АТСС.НВ2 (ТЗ-А1); дорожки 3 и 4: АТСС.НВ5 (16-3-22S); дорожки 5 и 6: АТСС.НВ6 (17-3-3S); дорожки 7 и 8: АТСС.НВ8 < 19/178Ci). (Фотографии любезно предоставлены Ю. Рейд н А. Хэмбургер.)
V. Через 20—30 мин удалите салфетки и подсушите гель
струей горячего воздуха. Увлажните поверхность листа
фильтровальной бумаги водой и осторожно отделите бумагу от геля.
VI. Повторно подсушите гель и окрасьте его раствором Ку-
масси голубого в течение 10 мин. Тщательно промойте пластинку водой и оставьте на ночь в растворе для отмывки (смесь этанола с уксусной кислотой).
VII. Тщательно высушите гель, подсчитайте количество полос и отметьте их положение относительно профиля pH, определенного на основании измерений на этапе (III).
Фотография окрашенного геля приведена на рис. 4.11. В работе [8] приведены результаты применения ИЭФ в случае большого количества гибридом. Более подробно с методом ИЭФ можно ознакомиться в работе [48].
5. Банки данных о происхождении клеток
В настоящее время в банках клеток и в отдельных лабораториях хранится большое количество линий клеток. Во многие случаях данные о доступности и специфических свойствах этих линий не находят широкого распространения. Между тем информация подобного рода особенно нужна в случае гибридом: во-первых, из-за важности новых технологий для развития гиб-ридомных исследований; во-вторых, при каждом слиянии клеток можно получать большое количество, возможно, уникальных гибридом.
Любой организации, будь то институт или банк клеток, трудно характеризовать, систематизировать и распространять все линии существующих гибридом. Поэтому были выбраны группы заинтересованных ученых и организаций для создания компьютеризованных байков соответствующей информации о тысячах -клеточных линий, которые могут быть использованы научными и образовательными учреждениями. Роль этих информационных банков клеточных источников (CSIB —от английского cell source intormation bank) состоит в систематизации потока информации, касающейся происхождения и уникальных свойств специализированных линий .клеток и гибридом. Информационные банки не выдают сертификатов или индоссаментов. В большинстве случаев клетки поставляются индивидуальными учеными или организациями, участвующими в программе.
