Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
II. Осадите белки, добавляя 25 мл насыщенного раствора сульфата аммония при 4 °С и центрифугируй ^е. при 10 000 g в течение 30 мин.
III. Отбросьте супернатант и растворите осадок в 1—3 мл дистиллированной воды. Запомните конечный объем и степень концентрирования иммуноглобулинов (обычно в 8— 16 раз). Вплоть до проведения опытов храните при —60 °С.
IV. Сделайте 12 лунок диаметром 3 мм на расстоянии 12 мм друг от друга в агаре диффузионной пластинки, используя трубчатое сверло для пробок. Содержимое лунок отсосите пастеровской пипеткой, соединенной с любым стандартным вакуумным устройством.
V. Внесите по 10 мкл концентрированного раствора антител в каждую лунку для испытания.
VI. Для получения стандартной кривой внесите в лунки по 10 мкл серийных разведений соответствующих очищенных
мышиных иммуноглобулинов, включая концентрации 1;
0,5; 0,25 и 0,125 мг/мл.
VII. Поместите пластинки в герметичную влажную камеру при комнатной температуре и оставьте на 16—18 ч.
VIII. Измерьте диаметры колец преципитации и определите количество присутствующего иммуноглобулина, пользуясь стандартной кривой.
Рис. 4.10. Оценка с помощью иммунодиффузии количества иммуноглобулинов, продуцируемых различными линиями гибридом. Верхние лунки содержат исследуемый материал, а в нижние лункн вносится известное количество иммуноглобулина (1,25—10 мкг), используемого в качестве стандарта. (Фотография любезно предоставлена В. Сигель.)
Многие гибридомы продуцируют 25—75 мкг иммуноглобулина на 1 мл культуральной среды. Фотография, показывающая результаты типичного анализа, приведена на рис. 4.10.
Большинство гибридом получено путем слияния с линиями мышиных клеток, экспрессирующих одни и те же Н-2 детерминанты, и многие гибридомы синтезируют иммуноглобулины того же идиотипа. Следовательно, нужны иные способы идентификации секретируемых антител. ИЭФ обеспечивает разделение по крайней мере 50 000 мышиных иммуноглобулинов, поэтому этот метод часто используется для дальнейшей характеристики линий гибридом. Прописи агарозной основы и других растворов приведены в табл. 4.15.
Получение супернатанта гибридомы производится следующим образом.
I. Клетки гибридомы (желательно на стадии логарифмического роста) перенесите в какую-либо обогащенную, химически определенную среду, например в среду RPMI
4.5.3. Метод изоэлектрической фокусировки (ИЭФ) для дальнейшей идентификации
1640, содержащую инсулин (5 мкг/мл), трансферрин (5 мкг/мл) и натриевую соль селеновой кислоты (5 мкг/ /мл). Сыворотка в стандартных средах может мешать проведению ИЭФ.
II. Промойте популяцию клеток тремя сменами этой среды, каждый раз собирая клетки центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. Ресуспендируйте осадок, не сни-
Таблица 4.15. Реагенты для ИЭФ иммуноглобулинов гибридом
Агароза 1 1%-ный (вес/объем) раствор в дистиллированной во
де. Растворите нагреванием на кипящей водяной ба
не и до использования держите при 56 °С
Предварительно Для диапазона pH 3,5---9,5 (имеются в свободной-
смешанные продаже1*)
амфолиты
Фиксатор Метанол (150 мл)
Трнхлоруксусная кислота 100%-ная (вес/объем)
(25 мл)
20%-ная сульфосалнциловая кислота (86 мл)
БВ (350 мл)
Собирающая 0,01 М КС1
лпй ГТ CJ
среда Этанол (700 мл)
Раствор для
отмывки Уксусная кислота (200 мл)
БВ (1100 мл)
Краситель 5и0 мл раствора для отмывки
2,5 г Кумасси голубого. Фильтровать перед исполь
зованием
Катодный 1,0 М NaOH
электролит
Анодный 1,0 М Н3Р04
электролит
*) FMC Corporation, Rockland, Maine.
жая по возможности исходного отношения числа клеток к
объему среды.
III. Инкубируйте клетки гибридомы в этой среде при 37 °С в течение 5 сут, затем осадите клетки центрифугированием и соберите супернатант.
IV. Концентрируйте белки супернатанта преципитацией сульфатом аммония, как и в системе иммунодиффузии (разд.
4.5.2). Концентрация белка для ИЭФ должна быть не ниже 1,7—2 мг/мл. Может возникнуть необходимость пропустить концентрированный раствор белка через колонку с сефадексом G-25 для удаления следов сульфата аммония, мешающего проведению ИЭФ.
