Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
5. Pretlow T. G., Pretlow T. P. (1982). In: Cell Separation, Vol. 1, PretlowT. G., Pretlow T. P. (eds.), Academic Press, London and NY, p. 41.
6. Nijhof W., Wierenga P. K- (1982). Exp. Haematol., 10, Suppl. 12, 307.
7. Miller R. G., Phillips R. A. (1969). J. Cell Physiol., 73, 191.
¦8. Miller R. G. (1973). In: New Technigues in Biophysics and Cell Biology
Vol. 1, Pain R. H., Smith B. J. (eds.), Wiley, NY, p. 87.
9. Wells J. R. (1982). In: Cell Separation, Vol. 1, Pretlow T. G., Pretlow T. P.
(eds.), Academic Press, London and NY, p. 169.
Л0. Sanderson R. J., Bird К- E„ Palmer N. F., Brenman J. (1976). Anal Biochem.
71, 615.
.11. Watt S. М., Metcalf D., Gilmore D. J., Stenning G. М., Clark M. R„ Wald-mann H. (1983). Mol. Biol. Med., 1, 95.
12. Jemionek J. F. (1981). Transfusion, 21, 268.
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
JI. Мораска и Э. Эрба
1. Введение
Проточная цитометрия — это относительно новый метод, позволяющий оценивать несколько оптических параметров для каждой частицы в суспензии, например оптическую плотность, флуоресценцию и светорассеяние; определять их можно как поодиночке, так и все сразу. Каждое измерение проводится за несколько микросекунд; это обеспечивает сбор данных на большой популяции частиц. Возможность анализа оптических параметров частиц позволяет осуществлять их сортировку в сложных смесях по одному или более измеряемым параметрам. Методом сортировки можно характеризовать клеточную популяцию по светорассеянию — одному из параметров, дающему информацию об объеме или площади поверхности клеток. Два других обычно оцениваемых параметра — это оптическая плотность и флуоресценция.
Кроме сортировки клеток, функции более или менее уникальной для приборов этого типа, проточная цитометрия имеет значительные преимущества перед обычными микрофлуо-рометрией и микроденситометрией. Главным преимуществом является способность сканировать большие популяции за меньшее время по сравнению с обычными микрометодами благодаря возбуждению флуорохромов светом в течение короткого и постоянного промежутка времени. Это обеспечивает более точное и надежное измерение флуоресцентного излучения. Однако проточная цитометрия не может быть использована для анализа клеточной структуры и морфологии прикрепленных клеток, тогда как микрофлуорометрия и микроденситометрия специально предназначены для решения этих задач.
Анализ клеток проточной цитометрией в жидкой среде требует совершенно иных методов окрашивания по сравнению с окраской клеток на стеклах. Суспензия должна состоять из одиночных клеток, флуоресцентные зонды или другие красители должны быть специфичны и не вымываться из клеток в среду, флуоресцирующие красители должны возбуждаться какой-либо из линий аргонового или криптонового лазера, и в том случае, когда предполагается сортировка жизнеспособных клеток, краситель не должен быть токсичным.
В некоторых упрощенных установках более дорогие лазеры заменяются дуговыми лампами. Однако, несмотря на большее число спектральных линий, эти установки с дуговым освещением оказываются менее чувствительными. Размер компьютера и программное обеспечение являются другими факторами, ограничивающими применение проточных цитометров. Следует подчеркнуть, что нужно тщательно продумывать список комплектующего оборудования. Кроме цены выбор того или иного набора оборудования определяет пригодность установки к проведению определенного типа анализа или сортировки. Некоторые установки могут быть прекрасно приспособлены для многопараметрического анализа, но непригодны для сортировки клеток и наоборот.
2. Сборка оборудования
Установка состоит из следующих частей.
а) Система протока, обеспечивающая поддержание постоянной скорости движения одиночной клетки в пучке возбуждающего света, фокусируемого конденсорными линзами.
б) Оптическая система, выполняющая следующие функции:
I. формирование пучка возбуждающего света диаметром несколько микрон в участке прохождения клетки;
II. измерение потери света, обусловленной прохождением каждой клетки через световой пучок, рассеяния света под малым углом и в ряде случаев спектральных характеристик рассеянного света;
III. оптическая система должна улавливать рассеянный свет и спектральные характеристики флуоресценции, излучаемой клетками под углом 90° к возбуждающему световому пучку.
в) Быстродействующая аналоговая система усиления и анализа сигнала.
г) Аналого-цифровой преобразователь, способный переносить поток данных в память многоканального анализатора или компьютера.
д) Программируемый компьютер, обеспечивающий обработку данных.
е) Источник света, способный возбуждать флуоресценцию одиночных клеток с достаточно высокой плотностью энергии.
ж) В оборудовании, предназначенном для сортировки клеток, измерения, проводимые в реальном времени, могут быть отобраны пороговой системой, способной включать устройство, заряжающее часть текущей жидкости с выбранной клеткой положительным или отрицательным заря-
