Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
1. Коэнзимную способность аналогов определяли после их преинкубации с апоферментом, с последующим измерением ферментативной активности. Отсутствие активности могло быть обусловлено потерей собственно
115
каталитических функций модифицированным кофермен-том или неспособностью аналога связываться с аиофер-ментом
2. Для выяснения относительного сродства аналога к апоэнзиму последний инкубировали с избыточными концентрациями аналога и тиаминпирофосфата, взятыми в соотношении 1:1. Определяемая активность при этом должна снижаться, если аналоги связываются с белком «необратимо» (по типу неизмененного кофермента); в противном случае — оставаться неизменной.
3. О стабильности связи между апопируватдекарбо-ксилазой и модифицированным коферментом судили по активности, определяемой до и после пропускания через ссфадекс апофермента, предварительно преинкубирован-ного с аналогом. Для определения степени насыщения белкового компонента неактивными производными тн-аминпирофосфата их метили по фосфору и затем определяли радиоактивность в элюате.
Во всех трех случаях опыты проводили с пируватде-карбокенлазой пивных дрожжей в присутствии магния, взятого в насыщающей концентрации. Были получены следующие результаты [438, 443, 446—448]. 4'-Окси-4'-дезаминоТПФ, аналог кофермента, у которого аминогруппа заменена на гидроксил, не отделяется от апофермента при гель-фильтрации, снижает пируватдекарбокси-лазную активность на 50% при добавлении вместе с тиаминпирофосфатом в соотношении 1 : 1 и полностью лишен коферментной функции (табл. 12).
Согласно трем тестам, предложенным выше, это означает, что у данного аналога кофермента отсутствует группа, выполняющая каталитическую функцию, в то время как группы, участвующие в связывании с белком, остались неизменными. Другими словами, аминогруппа тиаминпирофосфата, которой нет в 4'-окси-4'-дезами-ноТПФ, выполняет каталитическую функцию (о чем говорилось выше при рассмотрении механизма действия тиаминовых ферментов) и не участвует в связывании с апоферментом (хотя предполагается наличие тесного контакта между данной группой и поверхностью белка) [433]. Подтверждается это и с другими аналогами тиаминпирофосфата, в которых аминогруппа отсутствует (дезамнноТПФ) или модифицирована (N-метилТПФ и N,N диметилТПФ) (см. табл. 12).
116
Таблица 12
Коферментная активность аналогов тиаминпирофосфата, относительное сродство их к апопируватдекарбоксилазе и стабильность связи между аналогами и апопируватдекарбо-
ксилйзой [515\
Пирофосфорилированные произ Относительная Коферментная Степень инги
водные указанных соединений стабильность активность • бирования
связи с апопи- пируватдекар
руватдекярбо- боксилазной
ксилазой * активности •*
Тиамин 100 100
4'-Окси-4' дезамннотиамин 100 0 52
Дезаминотнамин ---. 0 30
N-Метилтиамнн 1 0 25
N.N-Диметилтиамии --- 0 22
6'-Метил-4-нортиамни 100 22 ---
4-Нортиамнн 4 24 25
N-1-Пиридиновый аналог 0 1.1 11
N-3-Пирнднновый аналог 0 0 0
* Для ТГ1Ф принимается равной 100.
** Определяемая при соотношении аналог : кофермент. равном 1:1.
Для изучения функций атомов азота пиримидинового кольца кофермента были синтезированы два аналога, каждый из которых содержал только один атом азота в кольце [437, 446]. N 1-Пиридиновый аналог {VII) содержал азот в первом положении, а N 3-пиридиновый аналог (VIII) в третьем положении. Лишь первый из них проявлял коэнзимную активность, в то время как второй не обладал каталитической активностью и был неспособен связываться с апоферментом [446, 448].
Следовательно, З'-N-aTOM не является необходимым ни для осуществления каталитического акта, ни для связывания с белком, хотя в его отсутствие стабильность связи тиамининрофосфат-апонируватдекарбоксилаза снижается (см. табл. 12). В то же время атом азота, находящийся в первом положении пиримидинового кольца, необходим для осуществления тиаминпирофосфатом его коэнзимной функции. Способность N-1-пиридинового аналога (в противоположность N 3-аналогу) связываться с апоппруватдекарбоксилазой указывает на участие l'-N-
117
атома в образовании связи между коферментом и апо-ферментом. Эта связь может быть водородной, что согласуется с незначительной способностью тиаминпиро» фосфата связываться с апоферментом при pH ниже 5 (значение pH, соответствующее значению рК., удаления протона от l'-атома азота тиаминпирофосфата) [351]. Не исключается и возможность того, что связь Г-атома азота кофермента с белком опосредована через ион металла [163, 432, 546].
