Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
5. Гель-фильтрация 0 --- 39 58
(эксп. 4+магний)
. Г ель-фильтрация 3 9 --- ---
(эксп. 4+ТПФ4-магний)
Пируватдекарбоксилаза из Е. coli
7. Исходный экстракт 14 69 --- ---
8. Гель-фильтрация 0 30 ---
(эксп. 7+магний)
9. Гель-фильтрация 0 30 --- ---
(эксп. 7+ТПФ+магнии)
* В % от активности, измеренной с добавлением 6,53-10~* М ТПФ и 6,25-10-*М
магння.
обоими кофакторами, сохраняется 67% активности (эксп. 3), т. е. примерно столько же, сколько было в исходном бесклеточном экстракте.
Подобные результаты были получены с глиоксилат-карболигазой Е. coli, только в данном случае существенная активация фермента без добавления металла достигалась при более высоких концентрациях тнаминпиро-фосфата (табл. 15, эксп. 1—3).
Пируватоксидаза в бесклеточнь к экстрактах Proteus vulgaris была практически неактивна без добавления ко-
5 Г. \ Кочетов
129
факторов, но активность полностью проявлялась при добавлении тиаминпирофосфата (см табл. 15, эксп. 4). После гель фильтрации наблюдалась лишь частичная активация коферментом (эксп. 5). Фермент, преинкубиро-ванный с тиаминпирофосфатом и магнием и затем пропущенный через сефадекс, был неактивен без добавления кофакторов (эксп. 6). Подобным образом ведет себя и пируватдекарбоксилаза в экстрактах Е. coli (эксп. 7—9). Следовательно, эти два фермента связывают кофакторы обратимо.
Перечисленные выше ферменты характеризуются двумя общими свойствами: все они неспособны необратимо связывать магний (в отсутствие свободного кофермента) и все в той или иной степени активируются только тиаминпирофосфатом. Степень же связывания кофермента и прочность его связи с белком различны. Так, например, нативная пируватдекарбоксилаза пекарских дрожжей взаимодействует с тиаминпирофосфатом практически полностью необратимо (см. данные на стр. 125, эксп. 3), в то время как пируватоксидаза P. vulgaris и пируватдекарбоксилаза Е. coli — полностью обратимо (см. табл 15). Два других фермента — ацетолактатсинтетаза A. aerogenes (см. табл. 14) и глиоксилаткарболигаза Е. coli (см. табл. 15) —занимают в этом смысле промежуточное положение. Примерно половинные количества этих ферментов связывают тиамиипирофосфат обратимо, а оставшиеся количества — необратимо. Это может указывать на гетерогенность данных препаратов ферментов по их способности взаимодействовать с коферментом. В пользу такой возможности свидетельствует и то, что при незначительном смещении pH в щелочную сторону от пируватдекарбоксилазы пекарских дрожжей отщепляется только часть тиаминпирофосфата, оставшееся же количество остается прочно связанным с апоферментом [361]. От фосфокетолазы из Acetobacter xylinum примерно половина общего количества тиаминпирофосфата отщепляется довольно легко уже в процессе выделения и очистки фермента, а оставшееся количество каталитически активного кофермента не может быть удалено даже с применением достаточно жестких воздействий [451].
Пируватдекарбоксилаза пекарских дрожжей, частично разобщенная от кофакторов, после ее обработки из-
130
бытком тиаминпирофосфата и магния связывает кофермент практически только необратимо (см. данные на сгр. 125, эксп. 3). После полного разобщения от кофакторов способным к необратимому связыванию тиаминпирофосфата оказывается уже только 90% фермента (эксп. 6). Таким образом, в процессе разобщения пируватдекарбоксилазы часть ее теряет способность связывать кофермент необратимо, хотя сохраняет каталитическую активность. Последняя проявляется в присутствии избытка кофакторов.
Способность тиаминпирофосфата в отутствие магния активировать полностью разобщенную от кофакторов пируватдекарбоксилазу пекарских дрожжей могла быть обусловлена наличием в системе примеси металлов. Поэтому была предпринята попытка по возможности полно удалить металлы, которые могли присутствовать в компонентах реакционной смеси и влиять на свойства фермента в отсутствие извне добавленных катионов. С этой целью все реагенты обрабатывали смолой с высоким сродством к ионам двухвалентных металлов. Это. однако, не дало ожидаемых результатов: активация одним тиаминпирофосфатом все еще наблюдалась.
До последнего времени считалось общепризнанным (на основании известных литературных данных), что тиаминовые ферменты устойчивы в нейтральной и слабокислой среде, а подщелачивание среды благоприятствует отщеплению тиаминпирофосфата от холофермеита. Однако исследования, проведенные Решеляускайте и др. [48], заставляют пересмотреть категоричность такого суждения. Авторы выделяли пируватдекарбоксилазу (входящую в состав пируватдегидрогеназного комплекса) из мозга быка. В процессе очистки активность фермента снижалась и после гель-фильтрации исчезала совсем. Добавление тиаминпирофосфата и магния не активировало фермент. Как оказалось при дальнейшем исследовании, в нейтральной среде, в которой проводилось измерение ферментативной активности, тиаминпирофосфат не взаимодействовал с апоферментом. Связы вание кофермента (в присутствии магния) начиналось только при pH 8 и достигало максимума при pH около 9,2—9,6. Для восстановления пируватдекарбоксилазной активности апофермента (при добавлении тиаминпирофосфата) совершенно необходимым являлось наличие в
