Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Для этого апофермепт предварительно инкубировали с коферментом в присутствии рибозо-5-фосфата или фруктозо-6-фосфата и без них, а также в присутствии различных буферов, н только после этого измеряли транскетолазную активность. В каждом случае ставили пробы как с кальцием, так и без пего. При определении ферментативной активности функцию субстрата-донора выполнял кснлулозо-5-фосфат, добавляемый в систему в составе смеси фосфопентоз. Ввиду отсутствия индивидуального препарата ксилулозо-5-фосфата влияние на К-» для тиаминпирофосфата исследовали с фруктозо-6 фог-
107
Таблица 10
Влияние фосфосахаров и природы буфера на величину константы Михаэлиса для тиаминпирофосфата [21\
Во всех случаях pH 7,6. Опыты с фосфосахарами ставили в 5-10~2М глицил-глициновом буфере
Величина Km дли тиаынн-
Добавлено в пробу Концентрация, пнрофосфата, М-10’
М
без кальция с кальцием
Г лицил-глицин 510'2 2,7 2,9
То же 1,510-» 7,1 4,0
Трис-буфер 5-10-2 1Г) ,3 2,8
То же 1,5-10-» 80,0 2,8
Рибозо 5-фосфат 1,2-10-» 3,2
Фруктозо-Ь-фосфат 1,2-10-2 19,5 3,5
фатом, которым также служит субстратом-донором в транскетолазной реакции, хотя н со значительно меньшей эффективностью, чем ксилулозо-5-фосфат [134].
Как следует из данных, представленных в табл. 10, замена 5-10-2 М глицил-глицинового буфера на трис-бу-фер той же концентрации сопровождается повышением величины Km примерно в шесть раз. В 1,5*10“* М трис-буфере она повышается более чем в пять раз. Аналогичный эффект, хотя выраженный в меньшей степени, наблюдали и при повышении концентрации глицил-глицинового буфера. В присутствии кальция во всех случаях величина Кт была, по существу, одна и та же и равнялась той, которая определялась в 5-10-2 М глицил-глициновом буфере и без добавления двухвалентного катиона [21].
Рибозо-5-фосфат никакого влияния на Кт не оказывал, фруктозо-6-фосфат— тоже, но только в присутствии кальция. Без него константа Михаэлиса для тиаминпи-рофосфата увеличивалась примерно в 7 раз (опыты ставили в 5• 10-2 М глицил-глициновом буфере). Таким образом, влияние кальция на Km Для тиаминпирофосфата, получаемое в прежних опытах (см. рис. 21), можно также объяснить снятием ингибирующего действия триса и одного из субстратов транскетолазной реакции. Другие компоненты системы, используемой для измерения транскетолазной реакции, не исследовали. Но нельзя исключить возможность и их влияния на Km, по аналогии с тем, что наблюдалось в приведенных выше экспериментах.
108
ВЗАИМОДЕИСТВИЕ ТИАМННПИРОФОСФАТА С ТРАНСКЕТОЛАЗОИ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ
Для того, чтобы выяснить, в каком виде кофермент связывается с апотранскетолазой — в свободном или в виде комплекса с металлом, были поставлены следующие эксперименты [32]. Апофермент предварительно инкубировали с тиаминпирофосфатом, затем измеряли изменение оптической плотности при 320 нм, характеризующее (как будет показано дальше) взаимодействие с апотранскетолазой молекул тиаминпнрофосфата, которые, связавшись с белком, способны выполнять каталитическую функцию.
Суммарная концентрация свободных (т. е. не связанных с белком) двухвалентных катионов в системе была 1,8* 10-8 М. В случае связывания с апотранскетолазой только комплекса тиаминпнрофосфата с металлом, но не свободного тиаминпнрофосфата, концентрация реконструированного холофермента должна была бы быть не выше 1,8* 10-8 М (такова концентрация свободных катионов в системе). Это составляет лишь 0,4—1,2% от максимально возможного, так как концентрация апотранске-толазы в опытах была 1,43- 10-в—4,55-10_< М.
На самом же деле прн проведении экспериментов происходило образование около 77% холофермента от максимально возможного (табл. 11). Отсюда следует, что холотранскетолаза образуется из апотраискетолазы и свободного, не связанного с металлом, кофермента (это, естественно, не означает, что комплекс тиамннпирофосфата с металлом не может взаимодействовать с апо-ферментом).
Когда транскетолазную активность измеряли с использованием низкой концентрации тиаминпнрофосфата без предварительной инкубации кофермента с апофер-ментом, то наблюдаемая скорость ферментативной реакции менялась во времени с самого начала ее измерения [20]. Сначала она была сравнительно низкой, затем увеличивалась и лишь по прошествии определенного времени стабилизировалась. Особенно отчетливо это проявлялось в отсутствие добавленного извне кальция и с низкими концентрациями кофермента. С повышением содержания тиамннпирофосфата в системе продолжительность фазы начального замедления транскетолазной реакции
109
Таблица 11
Ргконстр щия холопр тсктолОзы из апотранскетолам и тиаминпирофосфата, измеряемая по изменению величины оптической плотности при 320 нм [32]. Исходное содержание свободных двухвалентных катионов в среде 1,8- 10~Ё М
