Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 37

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 86 >> Следующая

¦ 10-3 М кальция \
При относительно низких концентрациях катиона (1,0-10-4 М) максимальная скорость транскетолазной реакции не меняется; влияние металла сказывается лишь на величине Km для тиаминпирофосфата. С повышением
1 При добавлении в качестве активирующего катиона магния вместо кальция максимальная скорость транскетолазной реакции увеличивалась в большей степени, в то время как величина Km для тиаминпирофосфата не изменялась [286] -
104
1/v
- 0,8 jS,
- 2

=g=8=2>-o-J
i i i
-з / Z J
г/[тпр]-ю\н
Рис. 21. Зависимость скорости транскетолазной реакции от концент-|[286]И тиаминпиР°Ф° Фата ПРИ разном содержании кальция в среде
/ — металл не добавляли; 2, 3. 4, 5 — добавлен кальций в концентрации: Ы0~4. «10-«, МО-5. 5-10-* М
концентрации катиона Km продолжает уменьшаться, н в то же время начинает увеличиваться максимальная скорость реакции.
Такой характер влияния кальция на транскстолазную реакцию позволяет думать, что в данном случае взаимодействие металла осуществляется по двум металл-свя-зывающим участкам фермента. Это хорошо согласуется с наличием двух атомов кальция в молекуле холотранскетолазы. Присоединение кальция к одному из них сопровождается повышением сродства кофермента к апотранс-кетолазе: максимальная активность при этом не изменяется. Присоединение кальция к другому участку вызывает повышение максимальной скорости транскетолазной реакции, т. е. собственно активацию фермента. По-видимому, отщепление кальция именно от этого участка приводит к снижению ферментативной активности, определяемой только с тнаминпирофосфатом, о чем говорилось выше.
Приведенные данные коррелируют и в смысле различного сродства атомов кальция к ферменту. Сродство одного из них высокое, и его действие (влияние на Km) проявляется уже при относительно низких концентрациях (см. рис. 21). Сродство другого, влияющего на максимальную скорость транскетолазной реакции, ниже, и требуется более высокая его концентрация в среде для взаимодействия с транскетолазной и проявления активирующего действия.
105
ФУПКЦП011АЛЫ 1ЫЕ ГРУППЫ ТИАМИИПИРОФОСФАТV УЧАСТВУЮЩИЕ В СВЯЗЫВАНИИ КОФЕРМЕНТА АПОТРЛНСКЕТОЛ ДЗОП ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕП
Для выяснения того, какие группы (или части молекулы) тиаминпирофосфата участвуют в его взаимодействии с анотранскетояазой, было исследовано влияние на транскетолазную активность различных аналогов кофермента после их предварительной инкубации с апофер-ментом в присутствии кальция и низких концентраций тиаминпирофосфата [278].
Во всех исследованных случаях наблюдалось снижение величины определяемой активности. Действие аналогов, как и следовало ожидать, было чисто конкурентным к коферменту. Такой характер ингибирования аналогами кофермента обычно указывает па то, что их связывание осуществляется в активном центре.
Самая высокая величина ингибиторной константы была получена для тиамина (8-10-2 М), а самая низкая— для тиазолппрофосфата (2,4-10_e М). Тиаминмо-нофосфат занимает промежуточное положение—К.= = 2,7-10 5 М. Определенная в этих же опытах константа Михаэлиса для тпамнппнрофосфата составляла величину порядка 3,0-10 7 М [21]. Таким образом, по мере услож нення молекулы тнамииа (тиамин—>тиамипмонофосфат—>--^тиамиипирофосфат) сродство его к апоферменту увеличивается, что указывает на участие тиамнповой части кофермента и обоих фосфатных остатков в его связывании с активным центром транскетолазы, причем основной вклад вносит пирофосфатный остаток. Эго следует из сопоставлении величин соответствующих констант, приведенных выше. На это же указывает п очень низкая величина ингибиторной константы для тназолиирофосфата (2,4-10 8М). Хотя и свободный тиазол тоже способен ингибировать транскетолазу, конкурируя с коферментом за апофермент, но величина К, для него оказалась на несколько порядков выше, чем для его ппрофосфорилиро-ванного производного [21].
В данных опытах нельзя было сопоставить ингибирующее действие вышеуказанных аналогов тнаминпиро-фосфата с ингибирующим действием свободного пирофосфата, так как в присутствии кальция последний выпадал в осадок. В среде же без кальция ингибирование
КХ5
траискетолазы пирофосфатом, конкурентное по отношению к тиаминпирофосфату, было показано. По сравнению со свободным тназолом эффект выражен в большей степени, а по сравнению с тиазолпирофосфатом — в меньшей [21]. Заметим здесь, что точно так же, как и аналоги тиаминпирофосфата, действовал ион аммония, т. е. ингибировал транскетолазу, конкурируя с коферментом за эпофермент (Ki = 2 8-10 ' М). По-внднмому, именно этим объясняется его влияние па процесс отщепления тиаминпирофосфата от холофермепта.
При постановке экспериментов, в которых кальций извне не добавляли, был обнаружен интересный факт: константа Михаэлиса для тиаминпирофосфата равнялась примерно 3-10-7 [21]. То же самое значение, как мы только что видели, получено и в условиях, когда кальций в системе присутствовал. Таким образом, получалось, что кальций не влияет на величину К™, в то время как в прежних опытах (см. рис. 21) его влияние отчетливо наблюдалось. Разница в этих двух сериях экспериментов заключалась в том, что в прежних опытах при определении активности фермент добавляли непосредственно в спектрофотометрическую кювету, содержавшую все необходимые для этого компоненты (в том числе и субстраты) и в качестве буфера использовали 1-10“' М трис. В опытах же, которые рассматриваются в настоящем разделе, использовали 5-10_z М глицпл-глициновый буфер и перед определением активности проводили предварительную инкубацию апотранскетолазы с тиамннпиро-фосфатом или с тиаминпирофосфатом и кальцием. Поэтому было проверено, как влияет на активность добавление в преипкубируемые пробы субстратов п трис’а, т. е. в какой-то степени имитировались условия прежних опытов.
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed