Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кочетов Г.А. -> "Тиаминовые ферменты " -> 44

Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.

Кочетов Г.А. Тиаминовые ферменты — М.: Наука, 1978. — 234 c.
Скачать (прямая ссылка): tiaminovinoviefermenti1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 38 39 40 41 42 43 < 44 > 45 46 47 48 49 50 .. 86 >> Следующая

Существенное влияние на процесс реконструкции хо-лопируватдекарбоксилазы оказывает субстрат этого фермента— пировиноградная кислота. Ее наличие в среде не сказывается на состоянии равновесия между коферментом или магнием и апоферментом, однако константа скорости процесса реконструкции холофермеита увеличивается примерно в 10 раз.
123
к ТПФ ¦ Mg
к
Mg
-X-MR
auo ПДК *пк11
Тройной
комплекс
>ПК
+Mg КТПФ
к
Mi
I
-ПК
-X--Mg
Рис. 28. Реконструкция холопируватдекарбоксилазы (схема)
Суммируя полученные экспериментальные данные, Шелленбергер [433] предлагает следующую схему реконструкции холопируватдекарбоксилазы (см. рис. 28). Вначале тиамиипирофосфат и магний относительно быстро, обратимо и независимо один от другого взаимодействуют с апоферментом, в результате чего образуется «откры тый» тройной комплекс. Последний затем «замыкается» с образованием стабильного (квазинеобратимого) комплекса, т. е. холоэнзима. Эта стадия — лимитирующая в общем процессе реконструкции. И именно здесь проявляется активирующее действие субстрата. Лимитирующая стадия связана, «ак полагают, с конформационными перестройками в активном центре [254, 433, 438, 442].
Как уже указывалось выше, для константы диссоциации двойного комплекса апопируватдекарбокснлаза — тиамиипирофосфат было получено значение 6,5-10~4 М. В то же время в физиологических условиях концентрация тиаминпирофосфата в дрожжевой клетке на два порядка ниже. Поэтому следует предположить, что in vivo кофакторы встраиваются в пируватдекарбоксилазу пивных дрожжей уже непосредственно в процессе синтеза белкового компонента [432].
124
ВЗАИМОДЕИСТВИЕ КОФАКТОРОВ С ДРУГИМИ ТИАМИНОВЫМИ ФЕРМЕНТАМИ
Взаимодействие пируватдекарбоксилазы пекарских дрожжей с кофакторами исследовали Морей и Джуни [361]. Ниже приводятся данные о потребности в кофакторах нативной пируватдекарбоксилазы пекарских дрожжей:
Перед гель фильтрацией препарат фермента был преинкубирован (там, где это указано) в 110-1 М фосфатном буфере, pH 6,4, при 30° в течение 30 мин; кофакторы в преинкубируемую смесь добавляли в концентрации: тиаминпирофосфат — 2,1-10~3М; магний — 1-10~2М
Номер и условия эксперимента Активность
(без добавок)
1. Исходный экстракт из дрожжей 80
2. Гель-фильтрация (эксп. 1) 78
3. Гель-фильтрация (эксп. 1 + ТПФ -f магний) 97
4. После оттепления ТПФ 0
5. Гель-фильтрация (эксп. 4 + ТПФ) 45
6. Гель-фильтрация (эксп. 4 + ТПФмагний) 90
7. Гель-фильтрация (эксп. 6) 90
• Б % от активности, измеренной с добавлением 6,53-10-4М Т11Ф и 6f25*lO-eM магння.
Авторы показали, что в бесклеточном экстракте фермент присутствует на 80% в виде холофермента (эксп. 1). Добавление обоих кофакторов вместе и даже одного тиаминпирофосфата увеличивает величину определяемой активности на 20%- Пропускание исходного экстракта через сефадекс для удаления свободных кофакторов не изменяет процентное содержание холофермента (эксп. 2). Аналогичные результаты были получены и в том случае, если перед пропусканием через сефадекс экстракт преин-кубировали с магнием и тиаминпирофосфатом, взятыми в насыщающей концентрации (эксп. 3). Таким образом, как в исходном холоферменте, так и в реконструированном, кофакторы связаны необратимо.
После разобщения активность пируватдекарбоксилазы полностью зависела от добавления тиаминпирофосфата
125
и магния. Для выяснения вопроса о том, обратимо или необратимо связываются тиаминпирофосфат и магний с разобщенным апоферментом, его преинкубировалн с насыщающими концентрациями кофакторов, взятыми вместе или раздельно, пропускали через сефадекс и измеряли активность. Оказалось, что в отсутствие тиаминпирофосфата металл не связывается с белком.
В пируватдекарбоксилазе, преинкубированной с ти-аминппрофосфатом в концентрации, насыщающей фермент на 70%, после пропускания через сефадекс проявлялось лишь 45% активности (эксп. 5). Если фермент преинкубировался с обоими кофакторами, то после гечь-фильтрации сохранялось 90% активности (эксп. 6). Вторичное пропускание через сефадекс (эксп. 7) не влияло на активность.
Таким образом, холофермент, реконструированный в отсутствие добавленного магния, в результате пропускания через сефадекс теряет около 25% тиаминпирофосфата (судя по величине ферментативной активности). Если реконструкцию холопируватдекарбоксилазы осуществляли путем инкубации апофермента с обоими кофакторами, то при последующей гель-фильтрации теряется лишь 10% кофермента. Эти данные указывают на то, что связывание тиаминпирофосфата с апотранскетолазой пекарских дрожжей в присутствии двухвалентных катионов осуществляется иначе, чем в их отсутствие.
ЭДТА снижает степень реконструкции холофермеита только еелн он добавляется к апопируватдекарбоксилазе перед добавлением кофакторов или одновременно с ними. ЭДТА, добавленный после магния и тиаминпирофосфата, никакого влияния не оказывает. Это указывает на то, что в данном случае, как и в опытах с пируватдекарбок-силазой пивных дрожжей, образование холофермеита из апофермента и кофакторов осуществляется с низкой скоростью. Подтверждение этому было получено в экспериментах, где использовали низкие концентрации тиаминпирофосфата и измеряпи пируватдекарбоксилаз-ную активность через разные промежутки времени после смешивания исходных компонентов в отсутствие ЭДТА.
Предыдущая << 1 .. 38 39 40 41 42 43 < 44 > 45 46 47 48 49 50 .. 86 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed