Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Теперь рассмотрим каждый этап более детально. Итак, первым синтезируется фрагмент, который затем станет самой правой частью вирусной минус-цепи ДНК: он начинается с правого конца U5 и заканчивается у конца вирусной РНК — в левой части последовательности R (рис. 13.2, Б) [75]. Эта ДНК ковалентно связана с З'-концом тРНК-затравки, расположенной у правой границы U5. Достигнув конца РНК-матрицы, синтез останавливается. Эта задержка синтеза наблюдается как in vitro, так и in vivo, за что первый фрагмент ДНК, включающий U5 и R, называют strong-stop-ДНК.
Чтобы продолжить синтез минус-цепи ДНК, реввртаза в комплексе со strong-stop-ДНК должна «перепрыгнуть» с левого на правый конец вирусной РНК. Этот «прыжок» обеспечивается последовательностью R, строго повторенной на концах РНК, а также активностью РНКазы Н ревертазы., РНКаза Н разрушает R-фрагмент РНК в составе гибрида РНК—ДНК (рис. 13.2,5), что позволяет освободившейся минус-цепи ДНК соединиться с комплементарной R-последовательностью на правом конце РНК (рис. 13.2,5). Не вполне ясно, происходит ли этот «прыжок» на З'-конец той же РНК, которая служила матрицей для синтеза strong-stop-ДНК, или второй молекулы вирионной РНК. Так или. иначе, минус-цепь ДНК, содержащая лишь одну копию R-после-довательности, теперь может быть продолжена от правого к левому концу вирионной РНК (рис. 13.2, Д).
Подготовка к третьему этапу (синтез минус-цепи левого повтора LTR) начинается еще до завершения второго этапа (элонгация минус-цепи ДНК справа налево). Синтез минус-цепи правого LTR завершается копированием Ш-области РНК (рис. 13.2, Д). РНКаза Н, вероятно, продолжает разрушать РНК в составе новосинтезированного гибрида РНК—ДНК. После этого может начаться синтез плюс-цепи ДНК правого LTR, которая
•будет служить матрицей гаа третьем этапе -репликации—синтезе минус-цепи ДНК (рис. 13.2,6) [61, 100, 119]. В синтезе плюс-цепи' ДНК в качестве матрицы используется минус-цепь ДНК LTR. Затравкой для синтеза плюс-цепи ДНК, вероятно, является вирусная РНК, сохранившаяся к этому моменту около левой границы U3 (обозначение «рр» на рис. 13.2). Хотя эта плюс-цепь ДНК и синтезируется на матрице минус-цепи ДНК правого LTR, в результате она оказывается частью левого LTR (ом. ниже). Очень важно отметить, что синтез плюс-цепи ДНК продолжается за LTR и включает образование участка, комплементарного первым 18 нуклеотидам тРНК-затравки, которая продолжает оставаться ковалентно связанной с минус-цепью ДНК; этот участок обеспечивает возможность второго «прыжка» в ходе обратной транскрипции [177].
Вместе с тем синтез минус-цепи ДНК продолжается справа налево и завершается копированием сайта связывания затравки, поскольку следующие за ним области U5 и R уже удалены РНКазой Н (рис. 13.2,Ж). На этом завершается второй этап репликации ДНК.
Для начала третьего этапа синтеза минус-цепи ДНК требуется, чтобы ревертаза вновь сменила матрицу, на этот раз на плюс-цепь LTR. Этот второй «прыжок», вероятно, обеспечивается 18^ нуклеотидами фрагмента плюс-цепи, 'комплементарными тРНК. РНКаза Н, по-видимому, удаляет тРНК, спаренную с плюс-ДНК (рис. 13.2,3), после чего «освободившиеся» 18 нуклеотидов спариваются с комплементарным им участком на конце плюс-ДНК (рис. 13.2,Я). Затем синтезируется минус-цепь левого LTR (рис. 13.2,Л-), которая достраивается до конца и вытесняет минус-цепь правого LTR. Таким образом, плюс-цепь LTR, построенная исходно на правом LTR, оказывается слева. Затем достраивается оставшаяся часть плюс-цепи (рис( 13.2, Л) и в результате возникает тупоконечная линейная двухцепочечная ДНК с 'повторами LTR на концах.
Фаза III: интеграция вирусной ДНК
По крайней мере одна копия вирусной ДНК оказывается интегрированной с ДНК каждой успешно зараженной клетки, а большинство -клеток, продуцирующих 'вирус, содержит 4—10 копий провирусов [50]. 'Внедрившись в клеточный геном, провирус в дальнейшем реплицируется и передается дочерним клеткам вместе с остальной ДНК. Первые интегрированные провирусы обнаруживаются через 8 ч после заражения [189], большинство же копий вирусной ДНК интегрирует в течение 3 дней после заражения. Зараженная клетка может вновь заражаться тем же
вирусом, пока не приобретет резистентность к заражению в результате образования вирусного гликопротеина. По крайней мере некоторые из провирусов не в состоянии обеспечить продукции вируса, поскольку они не транскрибируются или оказываются повреждены мутациями. Первое вирусное потомство появляется еще до того, как клетка становится устойчивой к супер инфекции (обычно через 1—2 дня после заражения). Поэтому многие зараженные клетки могут вновь инфицироваться вирусами, появившимися в результате первого цикла репликации [50].
Свободные линейные провирусные ДНК представляют собой предшественники интегрированных провирусов. Следует отметить, однако, что процесс интеграции еще мало «сследован. Известно, что для -его успешного осуществления необходимы концы LTR, поскольку мутанты, утратившие эти последовательности, не способны к интеграции [131]. Интеграция требует также неизвестных -клеточных факторов [191]. Кроме того, видимо, необходима эндонуклеазная активность ревертазы, поскольку мутанты MuLV с делегированным С-концевым участком ревертазы не способны встраивать свою ДНК в клеточный геном (S. Goff, личное сообщение). Установлено, что эндонуклеаза ретровирусов птиц рр32^°г преимущественно связывается с определенными участками LTR ASLV [118].
