Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Очищенная ревертаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матр<ицах. Эта реакция нуждается в двухвалентных катионах (Мп2+ или Mg2+ в зависимости от вида вируса). Как и другим полимеразам, ревертазе, чтобы начать синтез, необходим короткий двухцепочечный участок (затравка). Затравкой может служить как РНК, так и ДНК, которые оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК. У ретровирусов затравкой для синтеза первой цепи ДНК служит определенная тРНК (триптофагаовая у RSV, пролиновая у MuLV и лизиновая у MMTV), З'-концевая часть которой связана с комплементарной ей последовательностью вблизи 5'-конца вирусной РНК [176]. Ревертаза специфично связывается с нужной тРНК, способствуя ее доставке к вирусной РНК [130]. В ходе синтеза ДНК фермент сравнительно часто ошибается [64], и многие возникающие провирусы оказываются неинфекционными, поскольку содержат точечные мутации [127].
На РНК-матрицах очищенный фермент обычно синтезирует одноцепочечную 'Шмплементарную ДНК (кДНК). Это позволяет использовать ревертазу 'при клонировании эукариотических мРНК [44], причем в качестве затравки применяют oligo(dT), комплементарный poly (А) -последовательности на З'-конце мРНК. В подобных опытах используют также склонность ревертазы синтезировать вторую цепь ДНК с образованием оамокомпле-ментарной шпильки, .когда фермент доходит до 5'-конца РНК-матрицы.
На вирусной РНК-матрице очищенный фермент способен синтезировать лишь короткий фрагмент одноцепочечной ДНК (strong-stop-ДНК, см. ниже) [75]. Однако в определенных условиях очищенные вирионы способны синтезировать полноразмерную инфекционную вирусную ДНК [146]. Скорость работы ревертазы in vitro заметно ниже, чем скорость работы других ДНК-полимераз [146, 189].
Вирусная РНКаза Н действует как экзонуклеаза, гидролизующая РНК в составе гибридов РНК—ДНК [60, 189]. Она гидролизует РНК в основном до 'олигомеров длиной 6—12 нуклеотидов, а не до отдельных нуклеотидов. Ниже будет показано, что удаление РНК из состава гибрида РНК—ДНК, предположительно осуществляемое РНКазой Н, — необходимое условие синтеза вирусной ДНК.
Эндонуклеазная активность ревертазы лучше всего проявляется на кольцевых ДНК, в которые она вносит одноцепочечные разрывы. С меньшей эффективностью ревертаза образует такие разрывы в линейной двухцепочечной ДНК и линейной одноцепо-чечшой РНК или размыкает ковалентно замкнутую кольцевую ДНК.
^вирусная РНК
В первой фазе вирусной репликации непосредственно участвуют несколько областей вирусной РНК (рис. 13.1 и 13.2,/) [26]. Каждый повтор LTR возникает из трех областей вирусной РНК: последовательностей R, U5h U3. Последовательность R (от англ. redundant — избыточная)—это короткий участок (от 30 до 60 нуклеотидов), дважды 'присутствующий в составе РНК — на ее левом (5') и правом i(3') концах [74, 156]. Poly (А)-участок, расположенный эа З'-концевой R-последовательностью и представляющий собой иосттранскрилционную модификацию РНК, не участвует в синтезе вирусной ДНК- Последовательность R формирует внутренний участок LTR и играет важную роль на ранних стадиях синтеза ДНК. Следующие за R 80—120 нуклеотидов с 5'-конца РНК называют последовательностью U5. Эта последовательность, присутствующая © составе РНК в виде одной копии, дуплицируется при формировании LTR, где она находится за R-областью. Расположенная 'перед R последовательность U3 локализована на З'-конце РНК и также дуплицируется в ходе синтеза ДНК. Из трех формирующих LTR фрагментов U3 наиболее вариабелен пО длине (0,2—1,2 kb) и нуклеотидной последовательности [182].
18 нуклеотидов, примыкающих справа к U5 в вирусной РНК, служат участками связывания тРНК, используемой в качестве затрав-ии при синтезе первой цепи ДНК. В вирионе эти 18 нуклеотидов спарены с 18 нуклеотидами З'-конца тРНК. Короткий богатый пуринами участок (10—20 нуклеотидов), непосредственно предшествующий U3 в вирусной РНК, служит, как полагают, затравкой при инициации синтеза второй цепи ДНК [100, 119].
Синтез вирусной ДНК
Идущий in vivo синтез вирусной ДНК кратко изложен в настоящем абзаце и детально разобран в последующих,^ также на рис. 13.2. Синтез вирусной ДНК начинается в течение первого часа после заражения с появлением одноцепочечной ДНК, комплементарной вирусной РНК. Это минус-цепь ДНК, поскольку вирусная РНК служит кодирующей плюс-цепью. Минус-цепь ДНК — единая и непрерывная молекула, хотя ода и синтезируется в 3 этапа с трех различных матриц. Понимание смысла каждого из этих этапов и есть ключ к повим'анию репликации ретровирусной ДНК. Напомним, что синтез минус-цепи ДНК идет оправа налево относительно РНК, поскольку комплементарная цепь имеет противоположную полярность. Вместо того чтобы начаться у 3'-конца РНК, синтез ДНК начинается с
тРНК-затравии вблизи ее 5'-конца (рис. 13.2,Л). На первом этапе синтезируется -последовательность, комплементарная фрагментам R и U5, расположенным перед сайтом связывания тРНК-затравюи (рис. 13.2, Б); эта последовательность, комплементарная самой левой части в РНК, окажется затем самой правой в вирусной ДНК. На втором этапе синтез минус-цепи ДНК продолжается «а нравом конце одной из двух вириоппых РНК и идет влево через сайт связывания тРНК-затравки (tb) возле левого конца РНК i(p«,c. 13.2,Д—13.2,Ж). На этих двух этапах образуется правый LTR путем соединения последовательностей, расположенных на левом и правом концах РНК, а также оставшаяся минус-цепь вирусной ДНК, за исключением левого LTR. На третьем этапе образуется левый LTR на матрице предварительно синтезированной 'плюс-цепи правого LTR (см. ниже, а также рис. 13.2, Е и 13.2, К).
