Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Кроме того, должно быть тщательно выбрано место пришивки гаптена к ферменту, так как это влияет на специфичность анализа. Показано, что специфичность анализа для гаптенов выше, если конъюгат фермент—гаптен получен способом, отличным от метода синтеза конъюгата гаптен—носитель, используемым для иммунизации.
Если при получении конъюгатов гаптен—носитель для иммунизации животных стараются пришить ~ 10 молекул гаптена на молекулу белка, то конъюгат гаптен—фермент должен отвечать составу 1 : 1. Поэтому для синтеза конъюгатов гаптен—фермент в настоящее время в основном используют методы с применением гетеробифункциональных реагентов.
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими карбоксильную группу. Самыми распространенными методами син-
теза конъюгатов гаптен — фермент являются методы, основанные на образовании пептидной связи между аминогруппой фермента и карбоксильной группой гаптена, предварительно активированной каким-либо реагентом:
Метод смешанных ангидридов. При взаимодействии гаптенов, содержащих СООН-группу, с изобутилхлорформиатом в безводном органическом растворителе при пониженной температуре легко получаются смешанные ангидриды, которые без выделения затем взаимодействуют с ЫН2-группами лизиновых остатков фермента:
Этим методом получают конъюгаты большинства гаптенов. Однако даже при 20—30-кратном избытке гаптена относительно фермента выход конъюгата не превышает 20—30%. Реакцию обычно проводят с добавлением основания (триэтиламин, трибутиламин) для удаления образующейся НС1.
Для разрушения слабой сложноэфирной связи, которая побочно возникает между активированной карбоксильной группой гапте-' на и тирозиновым остатком фермента, а также для удаления избытка непрореагировавших реагентов реакционную смесь после завершения реакции обрабатывают гидроксиламином.
Синтез конъюгата о-(карбоксиметил)морфина с малатдегидро-геназой.
8 мг малатдегндрогеназы нз митохондрий выделяют центрифугированием из суспензии фермента в насыщенном растворе (NH4)2S04. Осадок растворяют в
0,25 мл воды, диализуют 18 ч при 0°С против 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,5, и доводят объем раствора фермента до 1 мл буфером, содержащим 0,1 М фосфата иатрия и 0,05 М карбоната иатрия, pH 9,0. К. суспензии 514 мг (1,5 ммоль)
о-карбоксиметилморфниа в 15 мл безводного дйметилформамида при —5°С медленно добавляют 196 мкл (1,5 ммоль) изобутилхлорформиата и перемешивают 60 мнн. Этот раствор добавляют небольшими порциями к раствору фермента, поддерживая pH 8,8—9,0. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 0°С и 30 мнн прн комнатной температуре, затем днализуют 2 дия при 0°С против буфера, содержащего 4,1 М фосфата натрня н 0,05 М карбоната натрия, pH 9,0.
Карбодиимидный метод. Активацию карбоксильной группы проводят в этом методе с помощью водорастворимых карбодиимидов:
0-C-Z + NH2-(D ©-С—NH-©
о
гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида или я-толуолсульфоната - 1-циклогексил-3-(2-Гч-метилморфолиноэтил) -карбодиимида:
©-
СООН + RN=C=NR'
(г)— COOCNR'H - ©~NH2j
NR
(г)— CONH—(е) + HRNCNHR'
где RN=C=NR': или CH3CH,N=C=NCH,CH2CH2N (СН3)2 . НС1;
fO
CH,
nch,ch,n' о 2 l\__________/
so-
f\
CH,
Реакцию проводят обычно при pH 5,5—6 в течение нескольких часов. Недостатком метода является побочное протекание внутри-и межмолекулярной сшивки молекул фермента.
Синтез конъюгата зстрадиола с fi-D-галактозидазой.
К раствору 0,5 мг 6-карбоксиметилоксима эстрадиола в 1 мл 0,2 М фосфатного буфера, pH 6,7, охлажденного до 12°, добавляют 1 мг гидрохлорида
1-этил-3-(3-диметиламинопропил.) карбодиимида в твердом виде. Через 30 мин добавляют раствор 20 мг р-?)-галактозидазы в 1 мл того же буфера. После перемешивания в течение 16 ч при 4°С реакционную смесь диализуют в течение ночи при 4°С в 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 0,1 М NaCl, 0,01 М MgCl2, 0,1% NaN3 и хроматографируют на колонке (2,5X40) см с сефадексом G-25, уравновешенной тем же буфером.
Разновидностью метода является способ с применением N-окси-сукцинимида и дициклогексилкарбодиимида в органической среде:
(TV-СООН + C6H„N=NC6Hn —> (rV-COOCNHCgHjj
NC6H„
/СО—сн2 НО—N |
'со—сн2
(г}—соо—к
^со—сн2 \о—сн,
ГС”2-!®.». (Г)— CONH—(е)
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими аминогруппы. Метод с применением гомобифункциональных сшивающих реагентов. Самый простой способ получения конъюга-
тов ферментом с гаптенами, содержащими активные NH2-rpyimbi, состоит в простом смешении в щелочной среде фермента, гаптена и сшивающего реагента — глутарового альдегида или диметил-адипимйдата:
Однако выход конъюгата этим методом невелик и значительно падает его ферментативная активность. Лучшие результаты были получены при проведении реакции в 2 стадии. Сначала обрабатывают гаптен сшивающим реагентом, а затем уже добавляют его к раствору фермента.
Синтез конъюгата щелочной фосфатазы с тироксином.
