Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Известно несколько способов нахождения количества молекул гаптена, пришитых к носителю. Самый простой спектрофотометрический способ заключается в регистрации изменения поглощения раствора конъюгата при определенной длине волны по сравнению с исходным белком-носителем. Можно также рассчитать соотношение компонентов конъюгата из данных по молекулярной массе, полученных электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии доде-цилсульфата натрия или по аминокислотному гидролизу конъюгата. Если конъюгат получили путем пришивки гаптена к аминогруппам белка-носителя, то его состав можно определить по титрованию свободных аминогрупп в исходном белке и конъюгате. Наиболее точный расчет состава конъюгата получается с помощью радиоизотопного метода, в котором используют меченный радиоактивным изотопом гаптен.
Кроме количества молекул гаптена, конъюгированных с носителем, важно также, через какую группу связывается гаптен с носителем. Специфичность иммуногена будет тогда выше, когда функциональные группы гаптена (антигенные детерминанты) удалены от места связывания с носителем. Этот факт необходимо учитывать, например, при получении конъюгатов стероидов с носителем.
Методы конъюгирования гаптенов с носителями чаще всего основаны на образовании ковалентной пептидной связи между карбоксильной группой гаптена и аминогруппой носителя или, наоборот, аминогруппой пептида с СООН-группой носителя. Если же гаптен не содержит активной функциональной группы, то ее «вводят» различными химическими способами.
В данном разделе схематично будут рассмотрены методы получения конъюгатов гаптен-носитель для иммунизации.
Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содержащими карбоксильную группу. Наиболее широко распространен метод сме-шанных ангидридов, который состоит в простом эквимОлярном смешивании гаптена (Г) и БСА (Б) с изобутилхлорформиатом и основанием (N-метилморфолин, трибутиламин, триэтиламин):
(?)—СООН + С1СОСН2СН(СН3)2 ——- (?)—СОО—СОСН2СН(СН3)2 — ^ д" ¦¦
8 о
---(г)—C0NH—(б) + со2 + НОСН2СН(СН3)2
где © - гаптен; © - белок
Этим методом получаются конъюгаты, содержащие 15—30 молекул гаптена.
Синтез конъюгата Ы6-ацетил-Ы'-суксиниленвиомицин — БСА.
Раствор 100 мг (0,11 ммоль) Ь'6-ацетилвиомицииацетата в 50%-ном диокеане добавляют к раствору 12 мг (0,12 ммоль) янтарного ангидрида в 6 мл диоксана и перемешивают при комнатной температуре. В течение реакции раствор немного подщелачивают 0,1 н NaOH. Через 4 ч диоксаи отгоняют в вакууме и смесь хроматографируют на колонке с сефадексом SH-20 (2,5X95 см), используя в качестве элюента дистиллированную воду. Фракции 29—35 (по 10 мл), содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют. Получают 56 мг К6-ацетил-Х'-ге-мисукцииилвиомицина в виде белого аморфного порошка. 50 мг (45 мкмоль) модифицироваииого гаптеиа, содержащего СООН-группу, растворяют в 5 мкл диметилсульфоксида, добавляют при —-5°С при перемешивании 5,5 мкл (50 мкмоль) N-метилморфолина и затем 6,6 мкл (50 мкмоль) изобутилхлорфор-миата. Через 10 мии реакционную смесь добавляют к 50 мг (0,75 мкмоль) БСА, растворенного в 10 мл 50%-ного диоксаиа, и перемешивают 4 ч при 4°С. Во время реакции поддерживают pH 8,5—9,0, добавляя ОД н. NaOH, реакционную смесь хроматографируют иа колонке с сефадексом SH-20 (2,5X95) см, уравновешенной дистиллированной водой. Собирают фракции 26—34 (по 10 мл) и лиофилизуют. Получают1 43 мг конъюгата №-ацетил-№-сукцинилеивиомицин—БСА в виде белого аморфного порошка.
Конъюгаты могут быть получены и с помощью водорастворимых карбодиимидов, таких, как 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбо-диимид гидрохлорид или 1-циклогексил-З- (2-М'-метилморфолино-этил) карбодиимид-га-толуолсульфонат:
(г)—СООН + RN=C=NR'-------— (?)—COOCNR'H ®Z.NHV
NR
----- (f)—CONH—(Ё) + HRNCNHR'
I
где RN=C=NR’: или CH3CH2N=C=NCH2CH2CH2N(CH3)2 . НС1;
S03—f /-СН3
ИЛИ
/ \—n=c=«nch,ch,n/ \>
'—' Lw
Lil)
Реакция протекает при комнатной температуре, pH 5, за время от 30 мин до 1 дня.
Если гаптен плохо растворяется в водных растворах, то проводят реакцию в водно-органической среде (диметилформамид, диок-сан, тетрагидрофуран).
Синтез конъюгата трийодтиронина—БСА.
К раствору 50 мг БСА в воде добавляют при перемешивании 30 мг водорастворимого карбодиимида и затем 20 мг трийодтиронина в 5 мл диметил-формамида, pH раствора поддерживают при 5,5. Через 30 мии добавляют еще 10 мг водорастворимого карбодиимида и перемешивают 18 ч при комнатной температуре. Раствор диализуют против 0,01М фосфатного буфера в течение
1 дня при 4°С. Хранят при —20°С. К молекуле белка пришивается 13 молекул гаптена.
Другой разновидностью этого способа является метод с использованием N-оксисущинимида. На первой стадии карбоксильная группа гаптеиа активируется дидиклогексилкарбодиимидом в органическом растворителе и взаимодействует с N-оксисукцинимидом с образованием сукцииимидного эфира. На второй стадии активированный эфир реагирует с аминогруппами носителя с образованием пептидной связи:
