Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
§ 2. Получение конъюгатов фермент — белок
Для высокочувствительных методов ИФА необходимы конъюгаты белок—фермент, в которых белок сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивация фермента. Таким, требованиям наилучшим образом отвечает конъюгат белок — фермент состава 1 : 1. При увеличении числа молекул фермента существенно уменьшается иммунологическая активность белка, так как при этом возрастают стерические препятствия для протекания иммунной реакции и увеличивается вероятность того, что фермент окажется связанным с активным центром антитела или антигенной детерминантой антигена. В то же время при уменьшении числа молекул фермента, связанных, с белком, значительно понижается ферментативная активность по сравнению с ростом неспецнфических взаимодействий конъюгата.
Из реакционной смеси конъюгаты выделяют, диализом или путем гельфильтрации, а для очистки иногда применяют аффинную хроматографию.
В химических методах получения конъюгатов белок-фермент можно выделить две группы по типу сшивающих реагентов — гомо-бифункциональных и гетеробифункциональных. Кроме того, для получения конъюгатов белков с перокендазой хрена широко используется перйодатный метод. В последнее время все большее распространение получают нехимические методы синтеза конъюгатов белок-фермент, основанные на образовании иммунологической связи антиген-антитело.
Перйодатный метод (метод Накане). Этот метод был впервые предложен японскими исследователями Накане и Каваои (1974) и с тех пор наиболее употребим для получения конъюгатов антител или белков с пероксидазой хрена. Суть метода состоит в модификации пероксидазы хрена с образованием активных альдегидных групп, которые затем реагируют с аминогруппами антител с образованием основания Шиффа. Альдегидные группы в пероксидазе возникают при окислении перйодатом натрия углеводных компонентов фермента, аминогруппы которого предварительно или блокированы 1-фтор-2,4-динитробензолом или протонированы: -
Для стабилизации основания Шиффа конъюгат иногда обрабатывают боргидридом натрия. Однако наряду с увеличением стабильности конъюгата при обработке NaBH* ферментативная активность уменьшается приблизительно на 20%.
Синтез конъюгата пероксидазы хрена с IgG по методу Накане.
К-раствору, содержащему 4 мг пероксидазы хрена (RZ-3,0) в 1 мл воды, добавляют 0,2 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора NaI04 и перемешивают 20 мии при комнатной температуре. Полученный раствор диализуют против 0,001 М натрия ацетатного буфера, pH 4,4, в течение иочи при 4°С или хроматографируют на колонке (1ХЮ см) с сефадексом G-25. К модифицированной пероксидазе хрена добавляют 20 мкл 0,2 М натрий карбонатного буфера pH 9,5, и сразу же 8 мг IgG в 2 мл того же буфера. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, добавляют 0,1 мл свежеприготовленного водного раствора NaBH4 (4 мг/мл) и перемешивают 2 ч при 4°С. Полученпый конъюгат или осаждаю^ насыщенным раствором (NH.i)2S04 и затем диализуют, или хроматографируют иа колонке (1,6X35 ем) с сефадексом G-200, собирая фракции, относящиеся к первому пику. Для стабилизации конъюгата, добавляют БСА (1 %),,мертиолат (0,02%) или глицерин (50%) и хранят в небольших порциях при 4°С.
Получение конъюгатов с помощью гомобифункциональных сшивающих реагентов. Весьма удобным в качестве сшивающего реагента оказался глутаровый альдегид, который взаимодействует с е-аминогруппами лизиновых остатков антител и фермента. Механизм реакции глутарового альдегида с белками до конца не изучен. Одновременно протекает несколько реакций, приводящих к появлению смеси продукта, содержащих более прочные химические связи, чем в простых основаниях Шиффа. Однако в общем виде схему реакций можно записать в следующем виде:
2. (i)—N=CH(CH2)3CH=0 + NH,—@(Ё)— N=CH(CH2)3CH=N—(At)
Были разработаны одностадийный и двухстадийный методы синтеза. В одностадийном методе глутаровый альдегид добавляют к смеси фермента и белка, а в двухстадийном на первой стадии глу-таровым альдегидом обрабатывают только фермент, удаляют избыток альдегида, а затем уже к модифицированному ферменту добавляют белок.
Синтез конъюгатов с применением глутарового альдегида разработан в основном для пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и глюкоамилазы. Недостатком метода является невысокий выход конъюгата (1—10%) и поляризация белков, в результате чего теряется иммунологическая активность. К достоинствам метода относится его простота и то, что качество получаемого конъюгата удовлетворяет необходимым требованиям.
Синтез конъюгата тиротропина с щелочной фосфатазой.
100 мкл суспензии щелочной фосфатазы (концентрация ~5 мг/мл) в 2,6 М. (NH4)2S04 центрифугируют и осадок фермента растворяют в 150 мкл 0,1 М фосфатного буфера, pH 6,8. К 100 мкл этого раствора, содержащего 330 мкг фермента, добавляют 100 мкл тиротропина в ,100 мкл фосфатного буфера и 12 мкл 1,5%-ного раствора глутарового альдегида. После инкубации при 25°С в течение 3 ч реакционную смесь диализуют в течение ночи в 200 мл фосфатного буфера.
