Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Синтез конъюгата антител с производными изолюминола.
К суспензии 100 мг ABEI в 15 мл смеси вода — хлороформ (2 : 1) при 0°С добавляют 2 мл CSC12 в хлороформе (1 : 19). Смесь перемешивают 6 ч при 4°С, отделяют органическую фазу и упаривают под азотом. Остаток растворяют в СНС!3, фильтруют и снова упарнвают под азотом. Раствор 2,67 мг полученного производного изолюминола в 100 мкл диметилформамида добавляют к 1 мл IgG (10 г/л) в 0,1 М карбонатном буфере, pH 9,5, и инкубируют 12 г при 4°С. Конъюгат диализуют или хроматографируют на колонке (30ХД) см с сефадек-сом G-50 в PBS.
В люминесцентном иммунокофакторном анализе (ЛИКА) используются конъюгаты антигенов и антител с кофакторами АТР и NAD. Общая схема синтеза конъюгатов состоит в модификации кофактора введением СООН-группы с последующим ковалентным связыванием ее с молекулой антигена (или антитела). Ниже при-
ведена схема модификации АТР по методу Мосбаха и получения его конъюгата с инсулином:
2. (ins)—Ci
ХЮН
[>-о„
о
RN=C=NR'
(Q)—COOl/
сГ j
NH2(CH2)6NH2
(Q)—CONH (CH2)6NH2
2)6nhco-@
Синтез конъюгата АТР с инсулином.
5 г АТР (8,3 ммоля) добавляют к 100 мл водного раствора монойодуксус-ной кислоты (15 г, 80 ммолей), который предварительно нейтрализуют 2 М LiOH до pH 6,5. Смесь иикубйруют при 30 °С в течение 7 дней в темноте, поддерживая pH 6,5' с помощью LiOH. Получившееся N'-карбоксиметильное производное АТР (ATP-N'-CM) осаждают при —20°С добавлением 800 мл этанола, отфильтровывают, промывают спиртом ж высушивают н вакууме.
100 мл раствора ATP-N'-CM прогревают пр'и 90 °С в течение 1,5 ч, поддерживая pH 8,5 с помощью LiOH. Полученный продукт охлаждают, нейтрализуют 1 М НС1 до pH 2,75 и наносят на колонку (2,5x60) см с DOWEX 1X2 (С1~). Примеси элюируют 0,3 М LiCl, pH 2,75, а конечный продукт — линейным градиентом растворов 2 л 0,3 М LiCl, pH 2,75, и 2 л 0,5 М LiCl, pH 2,0. Фракцию, содержащую ATP-N'-CM, нейтрализуют 1 М LiOH, концентрируют на роторном испарителе до 50 мл объема, осаждают 500 мл охлажденной до 4°С смесью ацетои — этанол (1:1) и высушивают в вакууме. Выход составляет 50—60%.
10 мг инсулина растворяют в 2,6 мл 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,4, добавляют 30 мг солянокислого гексаметилеидиамина и 15 мг водорастворимого карбодиимида и 25 мг N-оксисукцинимида. Смесь инкубируют 1 ч при 4°С. Реакционную смесь диализуют 4 ч против 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,4.
К полученному раствору инсулина с гексаметиленовой «ножкой» добавляют 30 мг ATP-N'-CM, 15 мг водорастворимого карбодиимида, 25 мг N-оксисукцинимида и инкубируют 12 ч при 4°С. Реакционную смесь диализуют. Выход продукта определяют спектрофотометрически.
Расчет мольного соотношения инсулина и АТР в конъюгате проводят по формуле
г~) .280 гч _267
__ ^267 икс. ^260Еинс.
П 1267 п 1280 »
^280 АТР — АТР
где ?>280, ?>267, е280, б267 — оптические плотности конъюгата АТР-
инсулин и коэффициенты молярного поглощения для индивиду-
альных веществ при длинах волн 280 и 267 нм соответственно.
Содержание белка в конъюгате АТР — инсулин также определяют по методу Луори. Препарат конъюгата хранят при —20°С. Коферментативную активность определяют биолюминесцентным методом со светляковой люциферазой.
8
Получение и свойства иммобилизованных антител и антигенов
Гетерогенные методы ИФА включают стадию разделения свободного меченого компонента от образовавшегося комплекса со связывающим агентом. Задача разделения эффективно решается при использовании антител (или антигенов), иммобилизованных на нерастворимых носителях. Методы, основанные на данном подходе, известны под названием твердофазных методов ИФА.
Получение антигенов и антител, связанных с йосителем, является одной из существенных процедур при разработке твердофазного ИФА, гак как от степени сохранения стабильности и активности иммобилизованных препаратов зависят количественное характеристики метода и возможность его практического применения. Другой важной областью применения иммуно-j сорбентов для целей ИФА является очистка антигенов и антител для последующей метки ферментом или использования в качестве стандартного образца.
В связи с интенсивным применением иммобилизованных ферментов в биотехнологии методы получения различных нерастворимых производных соединений белковой и небелковой природы хорошо разработаны. Многие из них могут быть эффективными и для получения-иммобилизованных , препаратов антител и антигенов (иммуносорбентов). Чаще всего для целей твердофазного ЙФА приготовление иммуносорбентов осуществляют либо ковалентным связыванием, либо адсорбцией вещества на поверхности носителя.
§ 1. Носители, применяемые в иммуноферментном анализе
Ф Используемые в ИФА носители должны соответствовать ряду требований, обусловленных спецификой метода: 1) быть нерастворимыми при условиях, в которых проводится анализ; 2) обладать достаточной для аналитических целей емкостью (т. е. количеством иммобилизованного белка на единицу массы или площади поверхности носителя); 3) обеспечивать прочное необратимое связывание белка с носителем и стабильность препарата при хранении; 4) обладать минимальной способностью к неспецифическому связыванию компонентов, находящихся в анализируемых биологических жидкостях; 5) быть удобным для анализа в методическом плане, т. е. легко и точно дозироваться, быстро осаждаться, без потерь подвергаться процедурам промывки и т. д.
