Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
т
6) к у—
SS—\ V + HSCH2CH2C—OCH3 + NH2-@
NH
Модифицированный белок с 4-пиридилдисульфидной группой далее реагирует с ферментом, который или содержит, или в него предварительно вводят SH-группу. Удельная активность пероксидазы в конъюгате с IgG, полученным этим способом, сохраняется на 74%.
В связи с развитием методов синтеза конъюгатов белок—фермент с применением гетеробифункциональных сшивающих реагентов возникла необходимость в простых и эффективных способах введения SH-групп в молекулы белков или ферментов. В настоящее время применяют три метода введения SH-групп с помощью: a) SPDP; б) метил-4-меркаптобутиримидата в присутствии 4,4'-дитиодипиридина; в) S-ацетилмеркаптоянтарного ангидрида:
в) 0—NH2 + СН3С0—S-1----/ -СНН^0Н» 0—nhcochch2cooh
СН3СООН
SH
Введение SH-группы в пероксидазу хрена.
К раствору 2 мг пероксидазы хрена в 0,25 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 7,5, добавляют 1,8 мг S-ацетилмеркаптояитариого ангидрида (200-кратиый избыток) в 10 мкл диметилформамида и перемешивают 30 мин при 30 °С. Затем в реакционную смесь добавляют 50 мкл 0,1 М трис-HCl буфера, pH 7,0, 6 мкл 0,1 М раствора ЭДТА и 100 мкл 1 М раствора гидроксиламина и инкубируют 5 мин при 30 °С. Полученную модифицированную пероксидазу хроматографируют иа колонке (1x45 см) с сефадексом G-25 в 0,1 М фосфатном буфере, pH 6,0, содержащем 4 мМ ЭДТА.
Нековалентные методы. Все описанные методы синтеза конъюгатов белок—фермент основаны на образовании ковалентной связи между молекулами белка и фермента. Но не менее перспективным направлением для получения конъюгатов является путь с использованием высокоспецифических иммунологических связей антиген — антитело или межмолекулярных связей белок—белок.
Для получения конъюгата антител с пероксидазой хрена используют антивидовые антитела к ферменту, которые образуют так называемый иммунопероксидазный комплекс (пероксидаза—антитела
к пероксидазе, PAP). Аналогичный комплекс может быть получен и для щелочной фосфатазы:
©
Еще один метод, основанный на образовании иммунологической связи, получил название метода «гибридных антител». Смесь F(ab') 2-фрагментов молекул антител против определяемого антигена и фермента обрабатывают меркаптоэтанолом. При этом F,(ab')2-фрагменты обратимо диссоциируют на Fab-фрагменты. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, в результате образуются гибридные молекулы антител, специфичные к антигену и ферменту. При добавлении к гибридным молекулам фермента образуется конъюгат антитело—фермент:
Способность белка А стафилококка образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом антител используют для получения конъюгатов, в котором фермент, предварительно сшитый каким-либо химическим способом с белком А, соединяется с Fc-фрагментом антител через белковую «ножку»:
Перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин — биотин, который образуется с/(а~ 1015 М-> по схеме
Для этого метода предварительно синтезируют каким-либо химическим методом конъюгаты антител с биотином и фермента с авидином, а затем при простом смешивании реагентов — конъюгат.
• Все описанные выше нековалентные методы синтеза конъюгатов имеют следующие преимущества: 1) они просты в проведении;
2) в конъюгате практически полностью сохраняется ферментативная и иммунологическая активность; 3) метод позволяет получить универсальный реагент для ИФА различных антигенов.
{:
[Г(аЬ-)'2]р
'}
0 + (а) —— 0—0 ® »¦ 0—0...©
Синтез конъюгата антител с щелочной фосфатазой через авидин-биотиновый комплекс.
а. К 250 мкл раствора (1 мг/мл в диметилсульфоксиде) сукцииимидного эфира биотина, полученного из биотина, оксисукцинимида н дициклогексилкар-бодиимида, добавляют 250 мкл раствора (10 кг/мл) IgG и 750 мкл карбонатного буфера (pH 9,2). Разбавляют смесь 3,5 мл PBS, инкубируют 3 ч при комнатной температуре и диализуют 3 дия против PBS.
б. К 15 мг щелочной фосфатазы добавляют 100 мкл раствора авндина (10 мг/мл) и диализуют в течение иочи против PBS. Добавляют 10 мкл глута-рового альдегида до концентрации 0,2% в конечном объеме, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, разбавляют до 1 мл PBS н диализуют в течение ночи против PBS.
в. Разбавляют конъюгат антител с биотином в соотношеини 1/10 000 в PBS, содержащем 0,05% твин-20 и 2% сыворотки лошади, и добавляют равный объем конъюгата авидина с щелочной фосфатазой в разбавлении 1/500 в PBS. Смесь инкубируют 1 ч при 37 °С. Полученный комплекс с*габилеи При 4°С ие менее недели.
§ 3. Получение конъюгатов гаптен — фермент
Синтез конъюгатов гаптенов с ферментами основаны в принципе на тех же методах, что и синтез конъюгатов белков с ферментами. Однако есть ряд особенностей, которые необходимо учитывать при проведении синтезов. Во-первых, многие гаптены плохо растворимы в водных растворах и поэтому получение конъюгатов приходится проводить в водно-органической среде, что сказывается на ферментативной активности конъюгата. Во-вторых, бывает очень сложно очистить конъюгат от свободного фермента, а это приводит к высоким фоновым реакциям, а поэтому синтез должен быть выполнен с высоким выходом. В-третьих, для сохранения иммуногенных свойств гаптен должен быть пришит к ферменту через углеводородную «ножку», содержащую 5—6 атомов цепи.
