Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
о
^~StU 0—NH—С—
Конъюгаты по этому методу получаются с высоким выходом, без образования каких-либо еще полимерных продуктов и имеют обычно состав 1:1. Ферментативная активность в конъюгате полностью сохраняется.
Синтез конъюгата дигоксин — уреаза с помощью MBS.
К 0,4 мл раствора IgG (10 г/л) в 0,05 М фосфатом буфере, pH 7,5, содержащем 0,1 мМ NaCl (PBS) добавляют 100 мкл 8 мМ раствора MBS в диметнл-вформамиде, перемешивают 30 мин прн комнатной температуре н хроматографируют на колонке (1ХЮ см) с сефадексом G-25, уравновешенной PBS. К 3 мл раствора, содержащего модифицированный IgG, добавляют 13 мг уреазы и перемешивают 30 мин. Полученный конъюгат днализуют в течение нечи против PBS и хранят прн —20 °С с добавлением 50% глицерина.
Другим широко используемым гетеробифункциональным сшивающим реагентом является N-оксисукцинимидный эфир (4-карбокси-циклогексилметил)малеимид, который более стабилен, чем MBS.
Синтез конъюгатов этим методом проводят при pH 7. При более низких pH реагенты малореакционноспособны, а при более высоких pH конъюгаты менее устойчивы.
Малеимидные соединения, применяемые для получения конъюгатов, недостаточно хорошо растворимы в водных растворах и иногда выпадают в осадок во время проведения реакций. Для определения наиболее реакционноспособных, растворимых и стабильных сшивающих реагентов были проанализированы различные N-оксисукцинимидные и N-сульфосукцинимидные эфиры малеимид-ных соединений. Было показано, что конъюгаты Fab-фрагментов с пероксидазой хрена лучше всего получаются с использованием N-оксисукцинимидных эфиров 3-малеимидопропионовой или 5-ма-леимидомасляной кислоты:
/ Y-,
N-—0~C0—(CH2 (и = 3,5)
4 /
К гетеробифункциональным сшивающим реагентам относится и N-оксисукцинимидный эфир 4-йодацетил аминобензойной кислоты (SIAB). Этот реагент аналогичен по действию MBS и основан на способности йодопроизводных реагировать с SH-группой с образованием тиоэфиров:
nh2 + ч—о—со nhcoch2i
SIAB дает конъюгаты с большим выходом и высокой специфичностью, однако пока не нашел широкого применения.
Синтез конъюгата кроличьих антител против IgG-овцы с р-D-галактозидазой с помощью SIAB.
К раствору 3 мг (2,6-10~8 М) кроличьих лнтнтел против IgG-овцы в 3 мл О,ОС М фосфатного буфера, pH 7,0, добавляют 30 мкл раствора SIAB (3,6 мг/мл в тетрагндрофуране) н ннкубнруют в темноте в течение ночн прн комнатной температуре. К раствору добавляют 30 мкг (4,5 • 10~2 М) глнцнна для разложения избытка SIAB и ннкубнруют в темноте 3 ч прн комнатной температуре. Затем к охлажденному до 4°С раствору добавляют ЫО-9 М р-?>-галактозида-зы, доводят pH реакционной смесн до 7,8 и Поддерживают его таким в течение 2 дней. Далее к реакционной смеси добавляют 4-10~3 М 2-меркаптоэтанола для удаления непрореагнровавшнх веществ н ннкубнруют 3 ч прн комнатной температуре. Полученный конъюгат разбавляют глицерином (50%).
К гетеробифункциональным сшивающим реагентам относится также N-оксисукцинимидный эфир 3(-2-пиридилдитио) пропионо-вой кислоты (SPDP). С помощью SPDP 2-пиридилдисульфидные группы вводятся как в молекулу IgG, так и в молекулу пероксидазы хрена. Затем 2-пиридйлдисульфидное производное IgG восстанавливается дитиотреитолом с образованием' SH-производиого, которое далее реагирует с модифицированным ферментом путем дисульфид ного обмена:
(SIAB)
l. @H-nh2 +
г<
N—-о—COCH2CH2SS (SPDP)
2
@-nhcoch2ch2sh +
2. (ПХ)—NH2 + SPDP —— (0>-NHCOCH2CH2—SS—^
\
_r*
. ^x)—NHCOCH2CH2—ss + hsch2ch2conh—@
— (0h-NHCOCH2CH2—SS—CHjCHjCONH—(0 + hs—sf у
Синтез конъюгата пероксидазы хрена с IgG с помощью SPDP.
К раствору 10 мг ПХ в 2 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH -7,5, содержащего 0,1 М NaCl, добавляют по каплям при перемешивании 400 мкг SPDP, растворенного в 0,5 мл этанола..Смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мии и затем хроматографируют на колонке с сефадексом G-25 (1,6 x 25 см), уравновешивают фосфатно-солевым буфером (PBS) и собирают фракции, соответствующие первому пику. Аналогичным образом проводят реакцию 10 мк IgG и 10—15 мкг SPDP. Модифицированный фермент обрабатывают днтиотрентолом (25 мМ) и вновь хроматографируют на колонке с сефадексом G-25. Смешивают растворы пероксидазы, содержащей SH-группы, и IgG, содержащего 2-пнрнднл-сульфндные группы, н ннкубнруют при 4°С в течение 18 ч. Реакционную смесь хроматографируют на колонке с Со-А-сефарозой в PBS. Конъюгат элюируют PBS, содержащим Ю мМ метил-О-маннознд, н затем снова хроматографируют иа колонке с сефакрнлом S-200 (42Х95 см) в PBS и собирают фракции, обладающие ферментативной активностью. Конъюгат разбавляют в отношении I : 2 В 60%-ном глицерине в бора+ном буфере, добавляют мертнолат и хранят в маленьких порциях.
Другая группа исследователей предложила использовать несколько других реагентов для введения пиридилдисульфидной груп* пы: 3-(4-дитиопиридил)пропириимидат или имидаты с 4,4'-дитиоди-пиридииом:
