Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Метод аффинной хроматографии на иммуносорбентах используется для получения препаратов очищенных антител. Наиболее широкое распространение получили иммуносорбенты на основе CNBr-активированной сефарозы (фирма «Farmacia», Швеция). Выпускаемая в нашей стране CNBr-активированная агароза по своим основным параметрам (удельной емкости, отсутствию неспецифической сорбции) не уступает зарубежному аналогу.
Основные операции, используемые для получения иммобилизованных на CNBr-агарозе антигенов или антител, приведены в табл. 5.1.
Следует отметить, что при работе с иммуносорбентами на основе CNBr-активированиой сефарозы нельзя использовать буфер, содержащий аминогруппы (например, трис-буфер).
Получение фрагментов антител. При разработке некоторых модификаций ИФА может возникнуть необходимость использования конъюгатов фермента не с целой молекулой иммуноглобулина, а с тем ее фрагментом, который специфически связывается с молекулой антигена — Fab-фрэгментом. Обусловлено это прежде всего тем,- что Fc-фрагмент молекулы, ответственный за эффек-торные функции иммуноглобулина, обладает способностью неспецифически взаимодействовать с другими белками, сорбированными на носителях при проведении твердофазного ИФА. Эффект неспецифической сорбции определяется природой антигена, концентрацией сорбированного на носителе белка и рядом других факторов.
Получение Р(аЬ')2-фрагментов.
1.. Раствор антител (10—20 мг/мл) диализуют против 0,1 М Na-ацетэтного буфера, pH 4,5, при +5°С.
2. Затем в раствор антител вносят пепсин из расчета 0,2 мг на 10 мг IgG.
3. Смесь инкубируют при 37°С в течение 15—24 ч. Длительность инкубации
155
Таблица 5.1. Ковалентное связывание с CNBr-активированной сефарозоб
Операция Условия
1,. Взвесить требуемое количество CNBr-активированной сефа-розы 2. Промыть на стеклянном фильтре и дать набухать гелю 3. Растворить в буфере белок (антиген) 4. Смешать белковый раствор с суспензией геля 5. Блокировка оставшихся активных групп 6. Отмывка от несвязавшегося антигена 1 г высушенного препарата дает около 4,5 мл геля Использовать для промывки раствор 1 мМ НС1, а затем для уравновешивания и набухания — боратный или гидрокарбонатный буфер Использовать гидрокарбонатный или обратный буфер Гидрокарбонатный буфер: 0,1 М NaHC03 (pH 8,3), содержащий 0,5 NaCl Раствор должен содержать 5—10 мг антигена Два часа при комнатной температуре или ночь при +4 °С Гель промывается буфером, содержащим блокирующие соединения (16 ч при 4°С или 2 ч при комнатной температуре). Используются 1М этаноламнн или 0,2 М глицин, pH 8,0 Используется буфер, в котором осуществлялось ковалентное связывание (боратный или гидрокарбонатный), затем 0,1 М ацетатный буфер, pH 4, содержащий 0,5 М NaCl, после, чего гель опять уравновешивается боратным или гидрокарбонат-ным буфером
зависит от препарата пепсина и вида животного, от которого получена антисыворотка.
4. pH раствора доводят 1М NaOH до 8.
Б. Затем раствор IgG в буфере pH 8,0, обработанный пепсином, наносят на юлонку с сефадексом G-150 (либо ультрагелем АсА-44). При объеме смеси 1,0— 1,5 мч используют колонку 1,5X45 см, а при 2,0—2,5 мл — 2,0X45 см. Колонку предварительно уравновешивают 0,1 М Na-борэтным буфером, pH 8,0. Гель-фильтрация на АсА-44 приводит к более четкому отделению F(aB')2, чем сефа-декс G-150. Для IgG овец, морских свинок, козла и, возможно, некоторых других животных гельфильтрацию следует проводить в буфере pH 6—7, а не 8, поскольку изоэлектрическая точка этих белков близка к 8. Добавление в буфер для элюции БСА позволяет снизить уровень неспецифической сорбции в случае использования низких концентраций IgG.
' 6. Концентрацию Р(аЬ')2-фрагмента рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения eF(ab')a ~ Г — '-Л-СМ-*.
Получение Fab-фрагментов
1. Готовят раствор, содержащий 0,1—3 мг F(ab') 2-фрагмента в 0,45 мл
0,1 М Na-фосфэтном буфере, pH 6,0.
2. Добавляют 0,05 мл 0,1 М 2-меркаптоэтанола в том же буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА.
3. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 1,5 ч.
156
4. Освобождаются от солей иа колонке (0,9X15 см) с сефадексом G-25, уравновешенной 0,1 М Na-фосфэтным буфером, pH 0,6 с 5 мМ ЭДТА.
5. Разделение F(ab')2- и Fab-фрэгментов проводят гельфильтрацией на колонке (0,9X30 см) с ультрагелем АсА-22, уравновешенной тем же буфером.
6. Концентрацию Fab-фрагмента рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения sFab = 1,48 г—ьл.См—
§ 4. Тестирование антисывороток
Антисыворотки, полученные даже от одного животного, значительно различаются по своей способности связывать антиген. Для сравнительной характеристики и оценки качества антисывороток проводят их тестирование, которое позволяет решить следующие две важные задачи: во-первых, произвести отбор именно тех сывороток, которые по своим свойствам (специфичности, аффинности, авидности и концентрации присутствующих в них специфических антител) удовлетворяют требованиям иммунохимического, анализа, во-вторых, осуществить стандартизацию антисывороток при их промышленном-производстве для иммуноферментных наборов.
