Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Кровь, лишенная клеточных элементов, называется плазмой. В плазме содержится фибриноген, приводящий к образованию во всем объеме пробирки сгустка фибрина, который осторожно удаляется центрифугированием при 1000—2000 об/мин в течение 15 мин. Плазма, лишенная фибрина, называется сывороткой. Для удаления белков системы комплемента сыворотку прогревают в течение 30 мин при 56°С, при этом антитела сохраняют свою активность. Обработку крови и получение сыворотки надо проводить с максимальной осторожностью, избегая разрушения (гемолиза) эритроцитов. Наличие внутриклеточных белков и ферментов в сыворотке может приводить к появлению дополнительного фона в некоторых модификациях иммуноферментного анализа. Это замечание касается прежде всего использования антисывороток в гомогенных методах.
Хранение антисывороток. Нативную иммунную сыворотку можно хранить 3—6 мес без потери иммунологической активности в замороженном состоянии при —20°С, предварительно разливая ее во флаконы по 0,5—1 мл. Отмораживание-замораживание ведет к снижению иммунологической активности сыворотки, поэтому лучше замораживать ее небольшими порциями для одноразового употребления.
Удобно хранить антисыворотку в лиофилизованном состоянии в ампулах под вакуумом. В сухом виде антисыворотка сохраняет иммунологическую активность при комнатной температуре в течение 1—2 лет.
Размороженную или разведенную сухую сыворотку в растворе можно хранить при +4°С в течение недели, предварительно добавив в нее консервант — хлороформ (1:10 по объему), 0,1% азида натрия или 0,01% мертиолата. Следует иметь в виду, что консерванты могут быть ингибиторами ферментов-маркеров в иммуно-феремнтном анализе (например, азид натрия для перокси-дасы).
153
§ 3. Выделение и очистка антител
Для увеличения относительного количества антител обычно используют у-глобулиновую или IgG-фракции иммунной сыворотки. Наиболее полное выделение углобулиновой фракции без снижения ее иммунологической активности достигается при осаждении сульфатом аммония (30% от насыщенного раствора), после чего осадок длительно диализуется с частой сменой буферных растворов.
Другим широко распространенным способом является осаждение полиэтиленгликолем с Мг = 4000—6000. В 10%-ном растворе полиэтиленгликоля происходит агрегация всех белков с Мг> >150 000, в результате чего осаждаются белки углобулиновой фракции, а белки меньшей молекулярной массы остаются в растворе. (Обычно используют двухкратное осаждение 20%-ным раствором полиэтиленгликоля.) Этот метод позволяет очень быстро получить препарат углобулиновой фракции антисыворотки. Способ достаточно эффективный, если препарат не подвергается хранению при низких температурах. Длительное хранение полученного препарата с сохранением иммунологической активности возможно после предварительного тщательного диализа.
Антитела в большей части антигенов относятся к IgG-фракции иммунной сыворотки. С целью повышения чувствительности и специфичности анализа во многих случаях полезно использовать для сорбции на твердой фазе и для получения конъюгатов IgG-фракцию нативной сыворотки. Наиболее простой и доступный способ выделения IgG—метод ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе или ДЭАЭ-целлюлозе.
Выделение IgG-фракции кроличьей антисыворотки.
1. 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl, добавляют 6,26 г (NH4)2S04, перемешивают и инкубируют 12—16 ч при 4°С.
2. Выпавший осадок удаляют центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин), растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре.
3. После удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку (1X10 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером.
4. IgG-фракцию определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм, концентрацию рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения е=1,5 г~*-л-см-1.
Приготовление фосфатного буфера.
Для выделения IgG кролика используют 50 мМ фосфатный буфер (pH 8), содержащий 20 мМ ЭДТА. 8 г №гНР04-2Н20 и 7,4 г ЭДТА-Na растворить в 900 мл воды, довести pH до 8 1М NaOH и затем добавить воды до 1 л.
Выделение антител методом иммуносорбции. Специфичность сыворотки проверяется в реакциях с используемым для иммунизации препаратом антигена и с набором близких ему по структуре химических соединений. В случае недостаточно очищенного антигена возможны неспецифические реакции, обусловленные наличи-
154
ем антител к применяемым антигенам. Перекрестные реакции с другими соединениями могут наблюдаться при наличии у них химических структур, близких к структуре антигенных детерминант иммуногена.
Удаление неспецифических антител из антисыворотки обычно осуществляют с помощью метода адсорбции на соответствующем неспецифическом антигене. Адсорбция неспецифических антител в реакции преципитации с растворимой фракцией путём центрифугирования может привести к появлению в антисыворотке или растворимых комплексов Ат—Аг, или избытка добавленного Аг, присутствие которых влияет на способность антисыворотки реагировать со специфическим антигеном в ИФА. Наиболее удобно для адсорбции антисыворотки использовать антиген, иммобилизованный на твердой фазе. Добавляя такой иммуносорбент в антисыворотку или пропуская антисыворотку через колонку с иммуносорбентом, можно быстро освободиться от перекрестно реагирующих антител.
