Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
# Таким образом, использование производных изолюминола в качестве меток имеет ряд преимуществ: простота получения меченых соединений, высокое отношение полезного сигнала к фоновому, высокая точность и воспроизводимость результатов измерения.
142
Использование в качестве маркера в ХИЛ акридиновых эфиров. Одним из перспективных направлений ХИА является применение в качестве маркеров антигенов и антител эфиров акридина, в том числе с производными фенола. В процессе окисления перекисью водорода происходит разрыв сложной эфирной связи и образование соединения III, дальнейшее превращение которого приводит к возникновению электронно-возбужденного N-метилакри-дин« (соединение IV):
(О (II)
• Преимущество данного механизма окисления состоит в том, что переход в электронно-возбужденное состояние и излучение света происходит после разрыва эфирной связи, вследствие чего исключается влияние молекулы антигена или антитела на хеми-люминесцентную реакцию и достигается высокая чувствительность определения маркера (10-17—10~18 моль в образце).
К недостаткам метода следует отнести нестабильность конъюгата, обусловленную наличием легко гидролизуемой основной формы акридиновых эфиров. Вследствие этого накладываются ограничения на применение растворов со значением pH, превышающим 6,3.
Схемы ХИА на основе эффекта переноса энергии. Впервые эффект переноса энергии в растворе описал Ферстер (1949), который наблюдал тушение флуоресценции трипофлавина родамином.
143
Позднее им было показано, что этот эффект передачи фотона йт донора к акцептору проявляется в тех случаях, когда расстояние между ними не превышает 7 нм. Эффективность процесса переноса энергии определяется диполь-дипольным резонансом и обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором.
Важным фактором является расстояние между максимумами спектров хемилюминесцентного излучения донора и флуоресцентной адсорбции акцептора, при этом эффект переноса энергии выражается в смещении максимума спектра флуоресцентного излучения акцептора. При увеличении площади перекрывания спектров эффективность процесса переноса энергии возрастает.
Известно, что радиус Стокса молекул IgG с Мл=150 000 составляет около 4 нм, а расстояние до активных центров около 5,5 нм. Таким образом, если на поверхности белковой глобулы расположить 4—12 молекул флуоресцеина, то среди них найдется по крайней мере одна, которая будет акцептором энергии молекулы донора, связанной с активным центром антитела. Для того чтобы эффект переноса энергии между IgG и флуоресцеином наблюдался в растворе, необходимо, чтобы концентрация флуорохро-ма была не ниже, чем 1—10 мМ. Если принять во внимание, что концентрация антител при проведении иммуноанализа составляет 0,01 пмоль, то очевидно, что перенос энергии может наблюдаться только внутри комплекса антиген — антитело и отсутствует между несвязанными молекулами. Этот факт положен в основу гомогенных методов иммуноанализа, базирующихся на эффекте переноса энергии.
• Основные требования к выбору реагентов: 1) хемилюминес-центное соединение, являющееся донором энергии, должно иметь высокий квантовый выход в хемилюминесцентной реакции;
2) флуорохром, используемый в качестве акцептора, должен обладать высоким квантовым выходом флуоресценции; 3) расстояние между максимумами спектров излучения донора и акцептора (стоксовский сдвиг) должно быть достаточно большим.
Сравнительное изучение свойств различных соединений, используемых в качестве маркеров в ХИА и флуорохромов, позволило выбрать для проведения иммуноанализа в качестве хемилюминесцентного маркера антигенов — ABEI и флуорохромной метки антител— флуоресцеина (длина волны возбуждения 495 нм, излучения 525 нм).
При образовании комплекса антиген — антитело наблюдается снижение интенсивности излучения в диапазоне 460—487 нм и увеличение при 525 нм, регистрируемое с помощью двухволнового люминометра.
Гомогенный иммуноанализ на основе переноса энергии описан для определения ряда антигенов с МГ от 312 до 150 000. Отношение интенсивности хемилюминесценции уменьшалось приблизи-144
тейьно на 50—70% при связывании меченого антигена с мечены-мш антителами.
'Гомогенный анализ разработан для определения циклического АМР из эритроцитов цыплят и IgG сыворотки крови. Корреля-цияшолученных результатов с данными обычных гетерогенных методов удовлетворительна (для сАМР коэффициент корреляции r=0L91, для IgG — 0,96). Основное преимущество систем с детекцией! основанной на определении отношения интенсивности излучения при двух длинах волн, — это возможность устранения влияния образца.
Подход с использованием систем с переносом энергии только начинает разрабатываться в иммуноанализе и, безусловно, найдет применение как один из вариантов гомогенных методов иммуноанализа.
# Приведенный обзор данных по применению био- и хемилюминесцентных реакций в иммуноанализе позволяет заключить, что детектирующие системы на их основе обладают большими потенциальными возможностями в плане повышения точности и чувствительности методов иммуноанализа, разработки новых вариантов экспресс-определения, создания систем автоматического определения.
