Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
® Преимущества метода — сокращение времени регистрации (до 5 с) по сравнению со спектрофотометрическим вариантом ИФА, высокая чувствительность—1 нг/мл. Производные изолюминола ковалентно связываются с белком с помощью бифункциональных реагентов (водорастворимых) и водонерастворимых карбодиими-дов. Очень часто химически модифицируют с получением активированного эфира ABEI, который затем ковалентно связывается с молекулой белка.
ABEI как маркер потенциально обладает рядом преимуществ, позволяющих на основе этого маркера разрабатывать высокочувствительные методы иммуноанализа. Данные по использованию изолюминола как маркера приведены в табл. 4.11.
Большинство модификаций хемилюминесцентного анализа относятся к твердофазным методам иммуноанализа. Для разделения
140
прореагировавшего и непрореагировавшего конъюгатов используют полистирольные микропланшеты и пробирки, полиакриламидные шарики, нитроцеллюлозные мембраны, гельфильтрацию на сефадексе G-25 и т. д.
В литературе описан также гомогенный вариант ХИА с использованием конъюгатов биотин — изолюминол. При взаимодействии этого конъюгата с авидином в двух окислительных систе-
Таблица 4.11. Использование производных изолюминола в хемилюминесцентном иммуноанализе
Определяемое соединение Предел обнаружения, пг Конъюгат/люмннесцеитная система
Прогестерон 4,0 АВЕ1-Аг/Н202-М1Х *
Эстриол-16-глюкоронид 17,6 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Эстриол-16-глюкоронид 15 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Метаболиты стероидов мочи 30,0 АВЕ1-Аг/Н2ОгМПХ
Эстрадиол 1,5 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Тестостерон 1,0 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Лютеинизирующий гормон 0,2 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
IgG 500 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
АВЕ1-Ат/Н202-МПХ
Кортизол 3 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
20 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Ферритин 10 АВЕ1-Ат/Н202-МПХ
Церулоплазмин 10 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
• АВЕ1-М-амннобутнл-(М-этнл)нзолюмннол; МПХ — микропероксидаза.
мах: 1) окисление Н2О2, катализируемое лактопероксидазой при pH 8,4 и 2) окисление супероксиданионом в диметилформамиде — наблюдается усиление интенсивности свечения. Увеличение квантового выхода является следствием внутримолекулярных механизмов, обусловленных специфическими взаимодействиями. Этот же эффект обнаруживается при окислении конъюгата биотин-изолю-минол —.Н202 в присутствии микропероксидазы в диапазоне значений pH 8,6—13,0. Нижний предел обнаружения биотина конкурентным методом составляет ~50 нМ.
Производные изолюминола широко используются при количественном определении стероидов методами как гомогенного, так и гетерогенного иммуноанализа.
Процесс получения конъюгатов стероидов с хемилюминесцент-ным маркером включает два основных этапа: 1) модификацию стероида — введение в молекулу стероида карбонильной группы, ее активацию в присутствии карбодиимида и N-оксисукцинимида с образованием активированного эфира; 2) реакцию активированного эфира стероида с аминогруппой производного изолюминола
141
при щелочных значениях pH с образованием пептидной связй. Для очистки конъюгата используют тонкослойную хроматографию и характеризуют его либо спектрофотометрически, либо с помощью масс-спектрометрии.
В основе гомогенного хемилюминесцентного иммуноанализа стероидов лежит эффект усиления интенсивности хемилюминесценции при взаимодействии конъюгата стероид — изолюминол с антителами. Введение в эту систему свободного стероида ингибирует излучение, которое пропорционально концентрации добавленного стероида. Указанный принцип использован при разработке методов определения прогестерона, эстриол-16-глюкоронида, эст-риола. Несмотря на то что чувствительность этих методов сопоставима с РИА (5—10 мг), в ряде случаев собственная неспецифическая хемилюминесценция образца (плазмы или мочи) ограничивает возможности метода, затрудняет определение низких концентраций.
В гетерогенных методах ХИА стероидов для разделения свободной и связанной фракций конъюгата применяют вторичные антитела или уголь, активированный декстраном. Однако в этом случае так же, как и при постановке гомогенных методов ХИА, на результаты анализа влияет неспецифическая фоновая хемилюминесценция образца.
Наиболее простой способ снятия неспецифического фонового излучения состоит в использовании твердофазных вариантов метода. В качестве твердой фазы берут пдлистирольные пробирки, микропланшеты, полиакриламидные шарики. Иммобилизация антител (моноклональных или поликлональных) на полистироле осуществляется методом нековалентной физической адсорбции, а в случае полиакриламидных частиц — ковалентным связыванием. Различие в способах иммобилизации обусловливает некоторые различия в свойствах иммобилизованных антител. Из. всех перечисленных носителей полиакриламидные шарики, как правило, обеспечивают .повышенную стабильность и иммунореактивность иммобилизованных антител, более быструю кинетику специфического взаимодействия, что улучшает точность анализа и его воспроизводимость.
Коэффициенты корреляции данных, полученных для стероидных гормонов методами ХИА и РИА, достаточно высоки (г,= =0,94—0,98). Точность и воспроизводимость результатов иммуноанализа в существенной мере определяются конечной стадией регистрации излучения и сильно зависят от формы детектируемого сигнала.
