Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Аффинность антител. Традиционные методы определения аффинности антител, позволяющие вычислять константу равновесия, основанные на изучении связывания меченого антигена с антителами, были изложены в гл. 2, § 3. В основном в таких экспериментах применяются иммобилизованные антитела и антигены, ме-
tog2 п
Рис. 18. Титрование антисывороток (I — 4) к инсулину методом непрямого твердофазного ИФА:
по осн абсцисс — разведение разбавленной в 100 раз сыворотки (п), по осн ординат — оптическая плотность прн 430 нм продукта пероксидазного окнслеиня 5-амииосалнцнловой кислоты перекисью водорода. В качестве контроля (N) использована сыворотка крови ие-нммуинзнроваиного животного
159
ченные радиоактивной меткой (не вносящей существенных изменений в структуру антигена).
При использовании ферментных меток химическая структура меченого антигена может существенно отличаться от немеченого (так, например, могут быть получены конъюгаты с различным мольным соотношением антиген/фермент). В этих случаях полученные значения констант связывания характеризуют, как правило, взаимодействие в данной конкретной системе, вследствие- чего иммунная сыворотка, обладающая высокой аффинностью в реакции с конъюгатом одной структуры, может иметь значительно более низкие значения константы связывания с конъюгатом, полученным другим способом.
Если исследователь имеет дело с разработкой конкурентных методов ИФА, т. е. располагает набором иммунных сы-Рис. 19. Связывание конъюгата инсу- ВОрОТОК и конъюгатом анти-лин — пероксидаза (Инс — ИХ) с ад- г ,
сорбированными на полистирольном ген фермент, то важным эта-планшете антителами против инсулина, пом создания тест-системы невыделенными из разных сывороток: ляется выбор пары антитело—
по осн ординат — оптнчбская плотность А прн 1глит.1лгят yяп и ктрпиq viaitipйр<т 490 нм продукта пероксидазной реакции окис- КОНЪЮГаТ, Характеризующейся
ления о-фениленднамина перекисью водорода. Необходимой КОНСТЗНТОЙ ВЗ<Ш-
Констаиты связывания антител нз сывороток ___ ______ л______ ___ _
/ н 2 (в М—1) равны 10Ю и 109 соответствен- МОД6ИСТВИЯ. ДЛЯ ПрОВбДбНИЯ
но; N — контрольная нормальная сыворотка СКрИНИНГа Y'rJI06yjIHH0Byi0
фракцию каждой антисыворотки иммобилизуют на поверхности микропланшета и изучают ее связывание с имеющимся набором конъюгатов. Эффективное значение Ксвяз является величиной, обратной значению концентрации конъюгата, при которой связывается 50% активных центров на носителе.
На рис. 19 приведены кривые связывания иммобилизованных на полистироле антител к инсулину с конъюгатом инсулин — пероксидаза. Исследуемые сыворотки различаются по значениям эффективных констант равновесия. Для количественного определения инсулина могут быть использованы антисыворотка и конъюгат, эффективная константа связывания которых ~ 109 М-1. Для других тест-систем допустимое значение Кэф будет определяться требованиями, предъявляемыми к чувствительности и точности разрабатываемого метода.
Описанная процедура скрининга иммунных сывороток, как отмечалось выше, применима при наличии конъюгата антиген — фер-
160
мент. Получение такого конъюгата для широкого круга антигенов представляется непростой задачей. Более универсальным реагентом (коммерческим) являются антитела, меченные ферментом, поэтому остановимся на более общем подходе к определению аффинности антител в сыворотке или асците, основанном на твердофазном ИФА. Этот метод, предложенный Б. Фриге, позволяет определять константу связывания антител с антигеном (немечен-ным) при их взаимодействии в растворе.
Постановка метода включает две основных стадии: 1) проведение реакции антиген — антитело в растворе; 2) определение концентрации антител после установления равновесия с помощью метода твердофазного ИФА. Схема реакции в растворе в общем случае имеет вид
Аг-}-Атч^ АгАт.
Обозначим равновесную концентрацию связанных антител как Вр, а концентрацию свободного антигена как Fp, тогда можно записать следующее выражение (известное как уравнение Клотца):
[Ат]0 _ Кж Вр Fp
+ 1; (5-1)
Др = 1Ат]0-[Ат]; (5.2)
Fp=[Ar]0-?p. (5.3)
Если концентрации антител [Ат]0 и [Ат] определять методом непрямого твердофазного ИФА, то при определенных условиях проведения эксперимента .будет выполняться соотношение [Ат]/ [At]o=j4/j4o, где А и А0 — значения оптических плотностей, регистрируемых в ИФА, соответствующие концентрациям антител [Ат] и [Ат]0. Уравнение Клотца при этом условии может быть приведено к виду
-Л°-~= 1 -|--?-. (5.4)
° [Аг]0-[Ат]в.—а--
Аа
Таким образом, для определения Ка описанным выше методом необходимо знание начальной концентрации антител [Ат] о. Однако практически нахождение Кл проводится в иммунных сыворотках, или асцитах, где точная концентрация антител [Ат]о неизвестна. Если проводить реакцию комплексообразования в избытке антигена, то количество связавшегося антигена незначительно по сравнению с исходным и его концентрация после установления в системе равновесия будет близка к исходной т е. [Ar]0«.Fp. Если эксперимент проводится так, что выполняется условие [Аг]о^> 10[Ат]о, то
