Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 62

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 56 57 58 59 60 61 < 62 > 63 64 65 66 67 68 .. 115 >> Следующая

[Ат1о-4^-<ОАг]0, (5-5)
Aq
161
тогда уравнение Клотца преобразуется к виду -^о _| Кл
А0-А
[Аг]0
(5.6)
Если представить экспериментальные данные в координатах Ао/{Ао—Л)-^1/[Аг]0> то по тангенсу угла наклона прямой можно рассчитать /Сд.
Рис. 20. Определение константы диссоциации (Кл) комплекса перокеида-за — антитела к пероксидазе в координатах Клотца:
кривые 1 и 2 соответствуют значениям Kd 1,1 • 10-9 и 2,2 ? 10-9 М
Рис. 21. Кинетика связывания моноклональных антител с инсулином, ад-сорбирозанным на полистирольиом планшете для ИФА из раствора концентрации 1 мкг/мл. Комплекс инсулин — антитело выявлен меченными перэксидазой антимышиными IgG:
по оси ординат — оптическая плотность А при 405 им продукта пероксидазного окисления ABTS перекисью водорода
Таким образом, для практического осуществления' описанного метода необходимо, прежде всего, установить наличие линейной зависимости между концентрацией определяемых непрямым методом ИФА антител и регистрируемым значением оптической плотности. Для этого готовят серии разведений исследуемой иммунной сыворотки и изучают их связывание в непрямом методе ИФА. Обычно эти зависимости имеют вид кривых с насыщением. Для проведения эксперимента выбираются разведения антисыворотки, лежащие в линейном диапазоне кривой. Для установления равновесной константы диссоциации комплекса Аг-Ат концентрацию антигена варьируют в диапазоне от 10~6 до 10~8 М. На рис. 20 приведен график для определения Кл комплекса ПХ- Ат. Однако вычисленные этим методом значения констант диссоциации комплекса Ат-Аг являются эффективными, поскольку при выборе уравнения не учитывается влияние взаимодействия антител с антигеном, сорбированным на твердой фазе, на равновесие в растворе.
Экспериментально контроль влияния иммобилизованного антигена на равновесие в реакции Аг—Ат в растворе осуществляется
162
сравнением сигналов, полученных на стадии твердофазного ИФА в двух соседних рядах лунок. Для этого содержимое лунок одного ряда переносится во второй свободный, обработанный аналогично первому, после чего сравнивают значения сигналов. Если наблюдаемые различия не превышают 10% (что обычно достигается при проведении измерения в кинетическом режиме через 5— 15 мин), то можно полагать, что влияние иммобилизованного антигена на равновесия Аг—Ат в растворе незначительно.
Более точная оценка общего случая с учетом влияния иммобилизованного антигена может быть дана в рамках модели связывания лиганда с несколькими независимыми центрами связывания:
П П
Аг+2 Ат,ч^2 В* (на носителе); (5.7)
1 /=1
Аг4~Атч^5 (в растворе) (5.8)
Если К* — константа связывания антител с иммобилизованным центром связывания (Аг), а [Ат*]г-— концентрация различных субпопуляций антител, связывающихся с иммобилизованным антигеном, то нетрудно показать, что в этом случае окончательное выражение уравнение Клотца будет иметь вид
(5'9)
П
Обозначим (1+^к;*ЛАт*]ог) как С. Параметр С для реакций ряда i=i
антигенов был найден экспериментально, значение его не превышает 2—2,5. При этом оценка С получена в предположении, что реакция антител с иммобилизованным антигеном достигает равновесия. Кинетика этого процесса представлена на рис. 21, из которого видно, что время установления равновесия значительно больше используемого в эксперименте при определении константы. Поэтому полученное значение С является максимальным и максимальная ошибка, которая допускается при определении Кд, составляет 200—250%.
Метод может быть использован для вычисления констант связывания как поликлональных, так и моноклональных антител.
Моноклональные антитела и их применение в анализе
6
§ 1. Получение гибридом
Моноклональные антитела синтезируются отдельными клонами гибридных клеток (гиб-ридомами), которые впервые были получены в 1975 г. Келером и Мильштейном в результате соматической • гибридизации клеток миеломных опухолей и В-лимфоцитов, продуцирующих антитела после иммунизации животных соответствующим антигеном. К настоящему времени отобраны такие варианты миелом (например, линии Х63-А 8.6.5.3, р2/0-А и др), которые не способны синтезировать собственные иммуноглобулины, и вся «гибридомная продуктивность» выражается и синтезе огромного количества моноклональных антител с интересующей исследователя специфичностью.
Другой особенностью используемых для гибридизации клеток миелом является отсутствие у них фермента гипоксантинфосфори-бозилтрансферазы, участвующего в синтезе ДНК- Этот фермент обеспечивает запасный путь синтеза аденозинмонофосфата в тех случаях, когда нормальная цепь ферментативных реакций заблокирована (например, в присутствии ингибитора — аминоптерина). На питательной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-сре-да), такие миеломные клетки размножаться не способны. Вторым партнером для слияния служат иммунные лимфоидные клетки селезенки или лимфоузлов, которые сами по себе нежизнеспособны в культуре. Сомати-
ческая гибридизация клеток миеломы и лимфоцитов может осуществляться спонтанно, однако выход гибридом возрастает в присутствии 40—50% полиэтиленгликоля с Л1г=4000 и 7,5% диметилсуль-фоксида. Высокий выход гибридом может быть получен в приборе для электрослияния.
Предыдущая << 1 .. 56 57 58 59 60 61 < 62 > 63 64 65 66 67 68 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed