Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
5. Сформировавшийся осадок отделяют центрифугированием при 5000 об/мнн в течение 30 мин. Надосадок сливают, а осадок растворяют в дистиллированной воде до 1/10 объема исходного материала. Растворение производят на магнитной мешалке при +4°С.
6. Диализуют полученный раствор против Н20 дважды по 12 ч.
7. Раствор доводят до pH 2,3 добавлением 1 М НС1 и вносят кристаллический пепсин из расчета 100 мкг на 1 мл раствора. Смесь инкубируют в термостате при 37°С в течение 12—18 ч и нейтрализуют 1 N раствором NaOH до pH 7,2-7,4.
8. К полученному раствору добавляют 20%-ный водный раствор твин-80 до концентрации 2% и инкубируют 4—6 ч при комнатной температуре.
9. Полученный раствор промывают двухкратным объемом физиологического раствора на аппарате «Amicon» с фильтром ХМ-100 и концентрируют до 1/20 объема исходного материала.
10. Материал наслаивают по 2—3 мл на линейный градиент плотности сахарозы (от 15 до 30% в физиологическом растворе) в стаканах емкостью 35 мл. Центрифугируют при 23 000 об/мин в течение 14—18 ч. Затем градиент фракционируют и отделяют фракции первого белкового пика, определяемого на спектрофотометре при ?.—280 ни, содержащие HBsAg.
11. Полученные фракции объединяют и диализуют против физиологического раствора 24—48 ч при +4°С с последующим концентрированием до содержания белка 0,1—0,2 мг/мл.
12. Собранный материал разливают в ампулы и хранят при —20°С.
13. Полученный препарат очищенного HBsAg контролируют: а) на специфическую активность по ВИЭФ, величина которой должна быть не ниже 5 мкг на единицу тнтра; б) иа полноту очистки по РПГ. Полученный препарат ие должен давать линий преципитации с антнсывороткой к белкам плазмы человека.
Приготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена (Ат-ПХ)
Для работы используют ПХ с (А403/А280) =
=2,94-3,3.
1. Получение конъюгата Ат-ПХ осуществляют перйодатным синтезом по методике, описанной в гл. 8, § 2.
2. Конъюгат выделяют гельхроматографией на колонке (1,6X100) см с се-фадексом G-200, уравновешенным ФБ, при температуре +4°С. Скорость элюции
0,2—0,3 мл/мин. Измеряют оптическую плотность собранных фракций (по 3 мл) на спектрофотометре при длинах 280 нм и 403 нм. Объединяют фракции конъюгата, имеющие значение коэффициента связывания (K=Aio3/A2So) от 0,4 до 0,6; при Awa определяют концентрацию по ПХ, разливают небольшими порциями и хранят при —20°С,
271
Адсорбция иммуноглобулинов
на нерастворимом носителе
1. В качестве твердой фазы используют полисти-рольные планшеты, в лунки которых вносят по 0,2 мл раствора 1 gG-фракции, разведенной ФБ до конечной концентрации 20 мкг/мл. Инкубируют в течение ночи при 4°С и отмывают ТФБ.
2. Планшеты сушат на воздухе и хранят при —20°С в герметически закрытых пакетах с осушителем.
Постановка иммуноферментного анализа
для определения HBsAg
1. В лунки планшетов с адсорбированными антителами вносят по 0,2 мл исследуемой сыворотки или плазмы и инкубируют 2 ч ири 37°С. После завершения инкубации отмывают пробы пять раз ТФБ.
2. В луики вносят по 0,2 мл раствора конъюгата в ТФБ с концентрацией по ПХ И мкг/мл, содержащего 1 % нормальной сыворотки крови человека. Инкубируют 2 ч при 37°С. Затем отмывают пять раз ТФБ.
3. Вносят в лункн по 0,1 мл раствора субстратной смеси на основе о-фени-лендиамина (см. § 1 этой главы) и инкубируют 40 мин в темноте прн комнатной температуре.
4. После инкубации останавливают ферментативную реакцию добавлением 50 мкл 2 N H2SO4 в каждую лунку и измеряют оптическую плотность проб'на спектрофотометре при А=492 нм.
5. К каждому опыту ставится положительный контроль в трех повторах и отрицательный — в семи. Положительным контролем является сыворотка или плазма человека, содержащая стандартное количество HBsAg. Отрицательным контролем является сыворотка или плазма человека, не содержащая HBsAg и антител против HBsAg.
Интерпретация результатов
1. Определяют средние значения оптической плотности положительных и отрицательных проб. Отношение этих величин должно Превышать 10, в противном случае результаты не считаются значимыми.
2. Содержание HBsAg в исследуемых пробах определяется по отношению оптической плотности этих проб к среднему значению оптической плотности отрицательных контролей, умноженной на 2,1. Если оптическая плотность исследуемого образца выше этого значения, то он считается положительным на содержание HBsAg, если ниже — то отрицательным.
3. Пример. Среднее значение оптической плотности отрицательных контролей: Л к=0,075. Нижняя граница положительных результатов: /4„Х2,1 = 0,158, Оптическая плотность исследуемых проб:
Л0
0,165 ....
0,568 ....
0,093 ....
0,107 ....
4. Все положительные результаты должны быть подтверждены нейтрализацией. Для этого раствор конъюгата делят на две части и добавляют к одной сыворотку, содержащую антитела к HBsAg в высоком титре, а в другую — соответствующую нормальную сыворотку в той же концентрации. После параллельной инкубации двух проб положительного по предварительным данным об-
Содержание
HBsAg
+
+
272
р'азца вносят в одну из них конъюгат с нейтрализующей (иммунной) сывороткой, а в другую — с нормальной.
