Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
2. Добавление исследуемых образцов. При использовании в качестве исходного материала листьев картофеля исследуемый экстракт может быть разведен в 10—50 раз, в случае клубневого материала допускается разведение растительного экстракта в 5—10 раз. Отбор листьев для анализа следует проводить с учетом особенностей локализации вируса в растении в зависимости от фазы развития. Так, например, листовой материал на зараженность Y-вирусом картофеля следует брать из средней и нижней частей растения. М-внрус картофеля в молодых растениях обнаруживается лучше в нижних листьях, а в зрелых растениях верхние листья содержат больше вируса, чем средние н ннж-иие. В клубневом материале для определения вирусов наиболее эффективным является экстракт из глазковой части и проростков клубня.
Все анализируемые пробы вносят в лунки планшета в объеме 0,2 мл в ТФБ и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Для каждого тестируемого образца проводят 2—3 параллельных измерения. В качестве контрольных препаратов используют растительные экстракты из здоровых растений; при тестировании очищенных препаратов вируса контролем служит препарат гетерологнческого вируса.
В качестве положительного стандарта используют пул экстрактов листьев (или клубней) здоровых растений, в который добавлен соответствующий вирус в известной концентрации. Эта же биологическая жидкость без добавленного вируса служит отрицательным стандартом.
3. После окончания инкубации с антигеном содержимое лунок сливают и отмывают от несвязавшихся компонентов 4 раза ТФБ. Конъюгат к соответствующему вирусу разводят ТФБ до концентрации 14-2,5 мкг/мл по пероксидазе (изменение концентрации конъюгата зависит от аффинности используемых антител) и добавляют в лунки по 0,2 мл раствора. Инкубируют планшеты при 37°С в течение 1 ч и отмывают 4 раза ТФБ.
4. После отмывки вносят в лунки по 0,2 мл субстратной смеси на основе 5-ДС (см. § 1 этой главы), инкубируют при комнатной температуре в течение 30—40 мин. Результаты ИФА регистрируют визуально или спектрофотометрически прн Л,=450 нм.
Интерпретация результатов анализа
На основании статистической обработки результатов анализа за нижний предел обнаружения данным методом принимают концентрацию вируса (или разведение анализируемого экстракта), при котором регистрируемая оптическая плотность продукта ферментативной реакции в два раза
278
превышает аналогичный показатель для гетерологичного вируса или отрицательного стандарта.
При анализе растительного материала за отрицательный уровень принимают усредненное значение оптической плотности продукта пероксидазной реакции, полученное при анализе смеси экстрактов от здоровых растений. Например, среднее значение оптической плотности для отрицательных контрольных проб составляет 0,07 о. е. Нижней границей положительных результатов будет
0,07-2=0,14 о.е. Образцы, дающие оптическую плотность выше этой величины, считаются вируссодержащими.
Количественная оценка содержания вируса в исследуемом материале проводится на основании калибровочной кривой, отражающей изменение оптической плотности продукта ферментативной реакции при возрастание концентрации вируса в положительном стандарте.
При достаточности получения информации типа «да» или «нет» может проводиться визуальная оценка. В этом случае интенсивность окраски в измеряемых пробах сравнивается с интенсивностью для отрицательного и положительного стандарта. Прн разбивке цветовой шкалы в этом диапазоне цветов результаты анализа могут фиксироваться условными обозначениями:
--вирус отсутствует;
Н--материал заражен;
+-j--материал сильно заражен.
§ 6. Определение инсулина в сыворотке крови человека
Количественное определение инсулина является одной из мер, необходимых для диагностики и контроля эффективности лечения диабета.
Рассматриваемый ниже ИФА инсулина проводится методом последовательного насыщения (см. гл. 4, § 2), включающим связывание иммобилизованными антителами сначала определяемого инсулина, а затем конъюгата инсулина с пероксидазой и измерение ферментативной активности на носителе, величина которой пропорциональна начальной концентрации гормона.
Реагенты, материалы и оборудование,
необходимые для проведения анализа
Антитела к инсулину; стандартные растворы с известной концентрацией инсулина; конъюгат инсулина с пероксидазой (Инс-ПХ); реагенты для фотометрического или хемилюминесцентного определения активности ПХ на основе о-фениЛендиамина или люминола (см. § 1 этой главы); полистирольные планшеты (оптически прозрачные илн непрозрачные в зависимости от способа детекции ПХ); автоматические пипетки; спектрофотометр или люминометр.
Получение антител
Используется IgG-фракция антисыворотки морской свинки против инсулина, выделенная полиэтиленглнколем по описанной ранее методике (с. 277).
Получение конъюгата инсулина
с пероксидазой (Инс-ПХ)
1. Конъюгат Инс-ПХ получают перйодатным методом (см. гл. 8, § 2). Выделение конъюгата из реакционной смеси осуществляют ионообменной хроматографией на жидкостном хроматографе высокого разрешения (FPLC),
