Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Анализ на основе калибровочных зависимостей сопрялсен еще с одним нуждающимся в учете эффектом. Очевидно, что концентрации будут правильно измерены только в том случае, если антиген в образце и стандарте связывается антителами идентично. В качестве примера представим, что при проведении анализа «сэндвич»-методом комплекс антител со стандартным антигеном Аг! образуется с большей константой связывания, чем с исследуемым Аг2. Тогда одинаковый по величине сигнал будет регистрироваться при концентрации [Аг2] большей, чем [Ari], т. е. опре-деленно,е по калибровочному графику значение концентрации исследуемого антигена будет меньше истинной величины.
257
Неидентичность в свойствах антигенов может проявляться из-за видовых или тканевых различий, а также при существовании в исследуемой пробе нескольких форм антигена (например, молекула-предшественник, антиген-метаболит), каждая из которых обладает различным сродством к антителам. Эти вопросы следует анализировать в каждом конкретном случае отдельно с целью выбора правильной стратегии в приготовлении стандарта и интерпретации результатов анализа.
Форма представления калибровочного графика. На конечной стадии получения калибровочной зависимости экспериментатор в своем распоряжении имеет абсолютные значения регистрируемого параметра, соответствующие начальной концентрации антигена в стандарте. В дальнейшем форма графика, наглядность и удобство работы с ним зависят от того, что и в каком масштабе откладывается по осям.
Масштаб диапазона концентраций антигена в стандарте по оси абсцисс может быть выбран арифметическим или логарифмическим, что скажется на форме графика (рис. 49). Арифметический масштаб целесообразен при изменении концентрации определяемого соединения лишь в узком диапазоне. В широком диапазоне график имеет нелинейный вид, что затрудняет определение низких концентраций антигена, так как-начальный его участок сильно «сжат». В тех случаях, когда концентрация антигена в стандарте изменяется более чем на один порядок, лучше использовать логарифмическую шкалу.
Рис. 49. Вид калибровочного графика при логарифмическом (о) и арифметическом (б) масштабе абсциссы:
[Аг]о — концентрация определяемого антигена. А—регистрируемое в ИФА значение опти*-ческой плотности продукта ферментативной реакции
258
На оси ординат в ИФА также могут быть отложены различные величины. Чаще всего это непосредственно регистрируемый сигнал {например, при спектрофотометрическом методе детекции им обычно является оптическая плотность продукта ферментативной реакции, образовавшегося в системе за определенный интервал времени). Такая графическая интерпретация наиболее наглядна и позволяет быстро оценивать воспроизводимость результатов.
Возможность других способов представления ординаты зависит от методики анализа. Если при проведении ИФА используется меченый антиген, все молекулы которого обладают способностью взаимодействовать с антителами, то ордината графика может быть выражена в величинах, широко используемых в ра-диоиммунологическом анализе, а именно как процент связанной метки от начальной (или отношение концентрации связанной метки к свободной, свободной метки к связанной, связанной метки к исходной). Наиболее удобными для практических целей являются графики в двух первых координатах. Их форма сходна между собой и с графиками, приведенными на рис. 48. Однако в отличие от рис. 48 в этих случаях по оси ординат откладывается не экспериментальная, а расчетная величина и степень достоверности графика зависит от корректности расчета. Так, отношение концентраций связанного с антителами меченого антигена к свободным (B/F) может быть получено двумя путями: экспериментальным измерением F и вычислением В по разности [Аг*]0—F и, наоборот, экспериментальным измерением В и определением F по разности [Аг*]0—В.
При проведении РИА оба эти пути теоретически равноценны, так как реально регистрируемый сигнал (распад/мин), полученный от одной и той же концентрации связанной или свободной метки, одинаков. При проведении же ИФА теоретически не исключена вероятность, что активность фермента в комплексе иммобилизованное антитело — антиген-фермент будет отлична от его активности в несвязанном конъюгате. В этом случае регистрация одного и того же сигнала на твердой фазе и в растворе не может служить однозначным свидетельством о равном перераспределении начального количества конъюгата. Другими словами, экспериментально определив F и вычислив значение В как разность, получим истинное соотношение В/F, но, экспериментально измерив В (исходя из неизменности каталитической активности фермента в комплексе) и вычислив F, можно получить значение B/F, не отражающее реального перераспределения меченого антигена. Предположение об изменении активности фермента может быть подтверждено или отброшено только на основе проведения дополнительных экспериментов. Наиболее простым из них является одновременно определение В экспериментально и как разность ({Аг*]0—F). Совпадение полученного и вычисленного значения В
259
свидетельствует в пользу неизменности активности фермента в иммобилизованном комплексе.
