Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
2. Планшеты оставляют для адсорбции на 18—24 ч при 4°С.
3. Содержимое лунок сливают, отмывают от несвязавшегося вируса 3-кратно по 3 мин ТФБ.
4. Высушенные планшеты могут храниться в течение 2 месяцев при 4°С или 6 месяцев при —5-г—10°С.
5. Исследуемые сыворотки крови людей до и после вакцинации гриппозной вакциной разводят в 500 раз ТФБ.
6. В первые лунки вносят по 100 мкл раствора ТФБ (контроль без сыворотки). В остальные лунки—по 100 мкл исследуемых парных сыкороток (не менее 3 повторов на образец).
7. Планшеты оставляют на 2 ч при комнатной температуре.
8. Содержимое лунок сливают, отмывают 3 раза ТФБ и подсушивают на фильтровальной бумаге.
9. В лунки вносят по 100 мкл раствора конъюгата Ат-ПХ в ТФБ с концентрацией 500 нг/мл по пероксидазе.
10. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, затем отмывают три раза ТФБ.
11. В лунки вносят по 200 мкл свежеприготовленного субстратного раствора на основе 5-АС (см. § 1 этой главы).
12. Планшеты оставляют на 40 мин при комнатной температуре и фото-метрируют продукт ферментативной реакции при >.=450 нм.
Интерпретация результатов
1. Вычисляют разность (АЛ) между оптической плотностью сывороток после вакцинации и до вакцинации и среднеквадратичную ошибку а (см. гл. 10, § 3).
2. Иммунный ответ на вакцину считают положительным, если величина ДА равна илн превышает трехкратную ошибку метода.
§ 3. Определение поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg)
HBsAg — один из основных белковых маркеров вируса гепатита В. Анализ на наличие и динамику изменения концентрации этого белка необходим для контроля крови, предназначенной для переливания и приготовления препаратов иммуноглобулинов, а также для дифференциальной диагностики заболевания гепатитом и проведения массовых эпидемиологических обследований.
В основу описываемой ниже методики положены результаты работы по созданию ИФА HBsAg (С, А, Аракелов и др., 1984) и регламент по производ-
269
ству иммуноферментных наборов на HBsAg, выпускаемых Горьковским НИИ эпидемиологии н микробиологии Минздрава РСФСР.
Определение проводится «сэндвич»-методом ИФА, включающим адсорбцию антител против HBsAg на полистнрольных планшетах и последующее взаимодействие антигена сначала с иммобилизованными, а затем с меченными пероксн-дазой специфическими антителами. Регистрируемая на носителе ферментативная активность пропорциональна начальной концентрации антигена и служит характеристикой его содержания.
Реагенты, материалы и оборудование,
необходимые для проведения анализа
Антитела против HBsAg; положительный и отрицательный стандарты; специфические антитела, меченные пероксидазой (Ат-ПХ); компоненты для приготовления субстратной смеси на основе о-фенилендиамина; ФБ; ТФБ; полистирольные планшеты для ИФА; автоматические пипетки; спектрофотометр.
Выделение антител против HBsAg
Для выделения антител используют высокоактивные антисыворотки с титром не менее 1 :500 по реакции преципитации в геле (РПГ), не содержащие антитела к белкам нормальной сыворотки человека по РПГ.
1. Готовят колонку 2X15 см, заполняют ее DEAE-сефадексом А-50 и промывают 15—20 объемами 0,01 М фосфатного буфера, pH 8,0.
2. К 100 мл сыворотки, содержащей специфические антитела, добавляют 15 г (NH4)2SO4 и оставляют на ночь при 20°С.
3. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин н растворяют в 25 мл НгО. Полученный раствор диализуют при 4°С дважды по 12 ч против Н20 н дважды по 17 ч против 0,01 М фосфатного буфера (pH 8,0).
4. Раствор осветляют при 5000 об/мин в течение 30 мин и наносят на колонку с DEAE-сефадексом. Элюируют 0,01 М. фосфатным буфером (pH 8,0).
5. Собирают фракции по 5 мл и определяют содержание в них белка спектрофотометрически при Х=280 нм.
6. Фракции, содержащие максимальное количество белка, объединяют, диализуют против физиологического раствора и спектрофотометрически определяют концентрацию белка.
Концентрация белка должна быть 8—12 мг/мл. При меньшей концентрации необходимо довести ее до указанных значений, для чего удобно использовать прибор для ультрафильтрации.
7. Полученный препарат должен обладать удельной активностью не менее
0,1 мг/мл на единицу титра по РПГ.
8. Препарат разливают по ампулам и хранят прн —20°С.
Очистка HBsAg из сыворотки крови
1. Для получения очищенного HBsAg отбирают плазму с титром 1 : 8 и выше по реакции встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ), разводят в 2 раза физиологическим раствором и разливают во флаконы по 200 мл. Флаконы помещают в водяную баню с температурой 80±2?С и прогревают в течение 1 ч, затем флаконы охлаждают в холодной воде.
270
2. Образовавшийся во флаконе сгусток разделяют на мелкие части стеклянной палочкой и переносят в стакан гомогенизатора, где разрушают при ?000 об/мин в течение 1 мин.
3. Полученную суспензию центрифугируют при 18 000 об/мин в течение 30 мин и затем собирают надосадок.
4. К надосадочной жидкости добавляют физиологический раствор до объема, в 2 раза превышающего объем исходной плазмы. Затем к полученной смеси добавляют 50%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ; М, = 6000) в физиологическом растворе до конечной концентрации 15%. Добавление необходимого количества ПЭГ производят небольшими порциями при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Смесь инкубируют 12—14 ч прн +4°С.
