Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Эти же рассуждения правомерны и при откладывании по ординате значения В в процентах от начальной концентрации конъюгата. Недостатком последних графиков является отсутствие информации об абсолютном значении реально регистрируемого физического параметра. Например, масштаб ординаты графиков (B/F-f-[Ar]0) может быть в диапазоне (0—1) как в случае, когда максимальное значение регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции составляет 1 оптическую единицу (о. е.), так и 0,05 о. е., хотя получение достоверных результатов анализа по второму графику практически невозможно. Та же ситуация возникает при представлении результатов в координатах (% B-f-[Ar]0), если авторы не указывают, какому реально измеряемому значению соответствует процент максимального связывания.
Аналогичное представление данных возможно и в тех случаях, когда ИФА проводят с использованием высокоочищенных полнили моноклональных антител, либо их РаЬ-фрагментов.
Иная ситуация возникает, когда в ИФА применяют меченную ферментом глобулиновую или IgG-фракцию, содержание антител в которых точно неизвестно и может варьировать в довольно широких пределах. Как правило, более 80% меченых IgG в таких конъюгатах неспецифичны к определяемому антигену. В этих случаях возможна детекция только тех меченых молекул антител, которые в ходе анализа образовали специфический комплекс с антигеном на твердой фазе. На ординату калибровочного графика при этом наносят регистрируемый параметр, пропорциональной концентрации ферментной метки на носителе (например, о. е., о. е./мин и т. д.).
Калибровочные кривые в широком диапазоне концентраций антигена в стандарте, как правило, имеют нелинейный вид. При логарифмическом масштабе на оси абсцисс графики приобретают сигмоидную форму, прл арифметическом — гиперболическую. В некоторых случаях целесообразно перестраивать калибровочный график в координатах, в которых он имеет линейный вид. Чаще всего это необходимо при машинной обработке результатов анализа, которая проводится на простых ЭВМ. Сложный вид графика при этом может приводить к значительному увеличению времени счета. Наиболее простым подходом для линеаризации сигмоидных кривых является представление данных в координатах (logit Уч-logfAJo), где У — регистрируемый или расчетный параметр, изменяющийся пропорционально начальной концентрации
У
антигена; функция logit K=Inу——. Отметим, что спрямление в
этих координатах наблюдается во многих, но не во всех случаях. При ручной обработке результатов искусственная линеаризация
260
не является необходимой, так как при переходе от одних координат к другим реальная точность и чувствительность анализа, естественно, не меняется, но их визуальная (по графику) оценка затрудняется, ибо утрачивается связь с измеряемым физическим параметром.
§ 2. Определение антител
В плане интерпретации результатов определение антител представляет более сложную задачу, чем определение антигенов.
Ответить на вопрос, какая концентрация антител, специфичных к данному антигену, находится в исследуемом образце, можно только на основе графика, откалиброванного по некоторому стандарту антител. При получении такого «стандартного» препарата возникает ряд сложностей. Во-первых, антитела необходимо выделять в высокоочищенном состоянии, чтобы иметь возможность охарактеризовать концентрацию препарата. Для этого используют метод иммуноадсорбции, что, в свою очередь, определяется доступностью очищенного агента в количестве, необходимом для приготовления иммуносорбента.
Кроме того, приготовление стандарта зависит от того, какой класс антител необходимо измерять в ходе анализа. Далее встает проблема наличия свободной от антител сыворотки для приготовления разведений стандарта, которая далеко не во всех случаях может быть решена просто.
Помимо технических существуют сложности и другого рода. Как уже отмечалось в предыдущем разделе, использование калибровочной зависимости правомерно лишь в тех случаях, когда соединения в стандарте и образце идентичны по способности к связыванию. Выделение же чистых антител иммуносорбцией, проводимое чаще всего при экстремальных значениях pH или ионной силы, может приводить к изменению их константы связывания с антигеном. Таким образом основное условие применения калибровочной зависимости может нарушаться.
Допустим, что эта проблема также решена и константа связывания антител в процессе выделения не изменилась. И в этом случае еще нет оснований считать результаты, полученные по калибровочному графику, истинными. Как известно, иммунный ответ организма на антиген индивидуален. Поэтому даже в том случае, если для приготовления стандарта использовался большой пул сывороток, велика вероятность, что среднеэффективная константа связывания антител в измеряемой сыворотке будет отлична от этой величины для стандарта, что опять будет приводить к неправильному определению концентрации. В связи с изложенным вопрос о точном определении концентрации антител является весьма проблематичным и на практике он ставится крайне редко.
261
