Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
281
Получение конъюгата ТС-БСА и ТС-СИТ
Конъюгаты ТС-БСА н ТС-СИТ получены при связывании ТС-2-(о-карбоксиметилоксим) с белками методом смешанных ангидридов (см. гл. 7, § 1).
Антитела к тестостерону
Антисыворотки к тестостерону получают иммунизацией кроличьим конъюгатом ТС-БСА, в котором с молекулой белка связано не менее 20 молекул гормона. Отбор пригодных для анализа антисывороток проводят стандартным методом ИФА, используя планшеты с адсорбированным конъюгатом ТС-СИТ и меченные ПХ антнкролнчьи антитела. Используют антисыворотки, имеющие в ИФА тнтр 10~4—10-5. За титр принимают максимальное разведение исследуемой сыворотки, при котором регистрируемое значение оптической плотности продукта ферментативной реакции достоверно отличается от значений, полученных для нормальной сыворотки в том же разведении. В качестве нормальных используют кроличьи сыворотки, взятые до иммунизации.
Методика проведения анализа
1. В лункн полистирольных планшетов для ИФА добавляют по 0,2 мл раствора конъюгата ТС-СИТ в ФБ с концентрацией 1 мкг/мл. Инкубируют в течение ночи при 4°С, затем отмывают лунки водопроводной водой и ТФБ.
2. Для построения калибровочной кривой в отмытые лунки вносят по 0,1 мл стандартных растворов ТС в метаноле с известной концентрацией гормона (от 0 до 50 нг/мл) н по 0,1 мл специфической антисыворотки в разведении 1:10 000. В другие лунки вносят по 0,1 мл экстракта из препарата крови и
0,1 мл антнсыворотки в этом же разведении. В контрольные лунки добавляют по 0,1 мл нормальной сыворотки в аналогичном разведении. Инкубируют 18 ч при 4°С, затем отмывают лунки ТФБ.
3. Добавляют в лунки по 0,2 мл раствора конъюгата aHTH-IgG-кролика с пероксидазой в ТФБ, с концентрацией по ITX 1—2 мкг/мл. Инкубируют 1 ч при 37°С, отмывают ТФБ и добавляют по 0,2 мл субстратной смесн на основе о-фениленднамина.
4. Через 30 мин останавливают ферментативную реакцию добавлением 50 мкл 2 М H2SO1 и регистрируют оптическую плотность раствора при N = = 490 нм.
Интерпретация результатов
По данным измерения стандартных растворов строят калибровочный график и определяют по нему концентрацию тестостерона в экстракте.
Экстракция тестостерона из сыворотки крови
Используемый в п. 2 раздела методики экстракт получают следующим образом. К 0,5 мл образца плазмы (сыворотки) добавляют 10-кратный избыток серного эфира (по объему), встряхивают 10—15 мин, затем помещают пробирку в морозильную камеру. После замерзания осадка надоса-дочную жидкость (эфирная фракция) сливают и упаривают в водной бане при 40—45°С досуха. Сухой остаток разводят ТФБ до начального объема образца и используют для дальнейшего анализа,
Заключение
Первые работы по иммуноферментному анализу появились в начале 70-х годов. За это время данное направление стало одним из ведущих в области количественного и качественного определения антигенов и антител ИФА, с помощью которого детектируют химические и биологические соединения различной природы и молекулярной массы — от гаптенов до бактериальных клеток.
Методы ИФА постоянно совершенствуются. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой — углубляются и совершенствуются методики самого анализа. Это приводит к тому, что анализ упрощается, сокращается его время, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск возможности использования в качестве маркеров все новых и новых ферментов. Все большее влияние на развитие ИФА оказывают влияние химия высокомолекулярных соединений и техника полупроводниковой микроэлектроники. Использование достижений клеточной и генной инженерии способствует принципиальному изменению технологии получения реагентов для ИФА.
В техническом плане дальнейшее развитие ИФА связано с автоматизацией всех стадий анализа, что особенно актуально при проведении массовых обследований. С целью максимального упрощения использования ИФА в практике сегодня разрабатываются так называемые «безреагентные» системы, в которых все необходимые компоненты иммобилизованы или импрегнированы в пористую поверхность. Для проведения анализа необходимо только нанести образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вследствие образования продукта ферментативной реакции.
В настоящее время ИФА все шире используется в различных областях медицины, сельского хозяйства, биотехнологии. Основными направлениями его применения являются ранняя диагностика заболеваний человека, сельскохозяйственных животных и растений, проведение массовых эпидемиологических обследований, контроль качества продукции, выпускаемой медицинской, микробиологической и пищевой промышленностью, контроль донорской крови на станциях переливания крови и т. д.
Анализ данных по практическому использованию разработанных и созданных новых иммуноферментных аналитических систем позволяет предположить, что в ближайшие годы роль ИФА в научных и практических исследованиях будет неуклонно расти.
Литература
1. Петров Р. В. Иммунология. — М.: Высшая школа, 1983.
2. Иммуноглобулины / Под ред. Г. Литман, Р. Гуд. — М.: Мир, 1981.
3. Структура и функция антител / Под ред. Л. Глинн, М. Стьюард. — М.: Мир, 1983.
