Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.
Скачать (прямая ссылка):
характеризующаяся наиболее высокими значениями c0t1/2), отвечает
уникальным последовательностям, представленным в геноме однократно.
Фракции, ренатурирующие более быстро, соответствуют семействам идентичных
или очень близких последовательностей, каждая из которых характеризуется
определенным значением константы скорости, отражающим сложность (N)
семейства. Долю генома, занятую последовательностями того или иного типа,
можно оценить по ординате графика, представленного на рис. 9.4.
Рестрикция ДНК и ферменты модификации
Практически все виды бактерий синтезируют по одному или по несколько
типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности
эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти
эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми),
поскольку их основная функция состоит, по-видимому, в ограничении
присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально
означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции,
защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также
модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых
ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и
модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то
вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько
порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная
ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в
соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются
экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК
до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция
приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже
модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие
бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации).
Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем
рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых
препаратов соответствующих ферментов.
9. Методы работы с ДНК
267
Таблица 9.1. Последовательности, узнаваемые некоторыми рестрикционными
эндонуклеазами
Микроорганизм
Фермент
Сайт узнавания
Число сайтов узнавания в вирусном геноме
SV40
Аденовирус 2
Escherichia coli K.Y13
Hemophilus aegyptius
Eco RI
Hemophilus influenzae Hitl dll
Hin dill
Hemophilus parainfluenzac Hpa I
Нра II
Пае III
i *
5' G A A С T T
\
5' G T Py С A Pu
4
5' A A G
T T С
\
5' G T T
С A A
I*
С С G G
\
5' G G С С
T T С 3'
A A G
* т
Pu А С 3' Py Т G \
С Т Т 3'
G А А
т *
А А С 3'
Т Т G
N
G G 3'
С С
•Т
С С 3'
G G
\
34
>20
11
18
>50
>50
>50
>50
1 Звездочками помечены основания, которые могут быть метилированы
ферментами модификации. Малыми стрелками указаны разрезы, производимые
рестриктазами типа II. Длинная вертикальная линия-ось симметрии. Pu-
пурин, Ру- пиримидин.
Размеры геномов: SV40 - 5224 н.п.; /.-48 502 п.п.: аденовирус 2-38 200
н.п.
Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие
эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную
последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК
неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго
специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную
последовательность и разрезают двойную спираль в определенной
фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы
рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают
двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее
конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз
второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать
препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями
нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие
из фрагментов, взятых из разных геномов.
Рестриктазы второго типа узнают палиндромные последовательности-
последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся
одинаково в обе стороны от оси симметрии. Рестриктазы третьего типа,
напротив, узнают асимметричные сайты. В табл. 9.1 представлены сайты
узнавания для нескольких рестриктаз. Как указано стрел-
18*
Организация и передача генетического материала Таблица 9.2.
Характеристика сайтов, узнаваемых рестриктазами
Фермент Сайт узнавания
Тип П (N = 7)
Е k I
Симметричный (N = 6)
Bal I TGG | ССА
Ват HI G | GATCC
ВсП Т | GATCA
Bgl II А | GATCT
Eco RI G | ААТТС
Hin dill А | AGCTT
Нра I GTT| ААС
Крп I GGTAC | С
Psfl CTGCA | G
Pvu II CAG | CTG
Sma I CCC | GGG
SacI GAGCT | С
Sac II CCGC | GG
Sal I G | TCGAC
Xba I T | CTAGA
Xho I CTC | GAG
Вырожденный симметричный (N = 6)
Acc I GT | (A/C)(G/T)AC
Aval С | PyCGPuG
Hoe I (A/T)GG | CC(T/A)
Hae II PuGCGC | Py
Hgi AI G(T/A)GC(T/A)|C
Hindll GTPy | PuAC
Симметричный (N = 5)
