Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Айала Ф. -> "Современная генетика. Том 1." -> 106

Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.

Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. Том 1. — М.: Мир, 1987. — 295 c.
Скачать (прямая ссылка): sovremennayagenetika1987.djvu
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 113 >> Следующая

Ира II Ват I Ира II
с\с g\g А Т с\с G G
Ит dill Alu I
С С A A G
GGCTTAA\GCC G G С\С Т A G\G С\С GGTTC
С Т Т G G G А\АС С
нами Са + + с тем, чтобы сделать эти клетки проницаемыми для ДНК. Затем
трансформированные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. На
таком агаре размножаются лишь те клетки, которые обладают фенотипом AmpR
и, следовательно, содержат восстановленную плазмиду или плазмиду с
встроенным фрагментом чужеродной ДНК. Колонии, выросшие на среде с
ампициллином, перепечатывают на чашки с тетрациклином. Клетки с
восстановленной кольцевой плазмидой, содержащей неповрежденный ген tet,
будут иметь фенотип TetR, тогда как клетки, в плазмиду которых встроен
фрагмент чужеродной ДНК, окажутся чувствительными к тетрациклину (Tets).
Клоны с фенотипом TetsAmpR можно отобрать для дальнейшего исследования
встроенных фрагментов ДНК.
Процедуру клонирования можно вести с помощью рестриктазы Sal I, а не Bam
HI, и точно так же отбирать колонии трансформантов с фенотипом TetsAmpR;
при этом будут клонироваться фрагменты чужеродной ДНК, специфичные именно
для Sail и отличные от фрагментов, клонируемых Ват HI. Можно также в
качестве рестрицирующего фермента при клонировании с помощью вектора
pBR322 использовать Pst I; при этом для дальнейших исследований природы
встроенных фрагментов следует отбирать колонии с фенотипом TetRAmps.
Химический синтез палиндромных двухцепочечных олигонуклеотидов,
получивших наименование "линкеры" (связывающие звенья) дает возможность
клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотносительно к
специфичности сайтов рестрикции. Эти короткие "тупоконечные" (т. е. не
обладающие одноцепочечными концами) молекулы двухцепочечной ДНК могут
ДНК-лигазой фага Т4 ковалентно соединяться с произвольными тупоконечными
фрагментами ДНК, которые мы хотим клонировать (рис. 9.13). Эти фрагменты
могут "выстригать-
280
Организация и передача генетического материала
Eco RI -сайты
4 4 4
Г еном мыши
Левое плечо
Правое плечо Обработка Eco RI
ДНК харон-фага Л
Внутренние
фрагменты
Удаление с помощью электрофореза внутренних фрагментов, несущественных
для репликации ДНК фага
f R т'
Частичное расщепление рестриктазой Eco RI в результате которого
образуются фрагменты длиной около 20 ООО н. п.
Слипание концов и сшивка
Т
R т'т L
R т'т L
R т'т L
I
Упаковка в головки фагов X in vitro
JJJX
11 ? t ?
I
[
Заражение E.coli рекомбинантными фаговыми частицами
Рис. 9.14. Использование харон-фага X для клонирования крупных фрагментов
ДНК мыши. Эффективное клонирование оказывается возможным благодаря
действующей in vitro системе упаковки, полученной из инфицированных фагом
X клеток Е. coli. Эта
Популяция харои-фагов X, содержащих в совокупности весь геном мыши
система содержит все структурные белки и ферменты, необходимые для того,
чтобы инфицирующие частицы фага были носителями векторной ДНК, в том
числе ферменты, разрезающие длинные контамерные молекулы ДНК.
ся" из любых молекул ДНК физическими методами; границы фрагментов при
этом не зависят от распределения сайтов рестрикции.
Геном бактериофага X был превращен генными инженерами в наиболее удобный
вектор для клонирования крупных фрагментов чужеродной ДНК. В геноме фага
X есть два участка, не содержащие генов, необходимых для литического
развития и производства потомства. Эти участки включают, соответственно,
22000 нуклеотидных пар в середине карты и 3000 между генами Р и Q (см.
рис. 7.7). Таким образом, около
9. Методы работы с ДНК
281
25000 пар нуклеотидов ДНК фага к можно заменить чужеродной ДНК, не
затрагивая способности этого фага выступать в роли вектора. Нормальный
геном фага к содержит 49000 нуклеотидных пар, однако головка фага может
вместить от 38 000 до 53 000 н. п., продолжая при этом функционировать
нормально. Можно сконструировать множество различных линий фага к,
предназначенных для клонирования разнообразных фрагментов чужеродной ДНК,
подчиняющихся лишь сформулированным выше ограничениям. Примерами таких
векторов могут служить так называемые харон-фаги к (по имени мифического
перевозчика в царство мертвых) и /lgt-фаги (осуществляющие общую
трансдук-цию). Они сконструированы таким образом, что гены, ответственные
за жизненно важные функции, локализованы на левом и правом концах генома,
а середина существенных генов не несет и кроме того ограничена двумя
различными сайтами рестрикции. Эта центральная часть генома содержит
гены, влияющие на морфологию колоний, так что по их форме можно сразу
определить, чужеродная или собственная ДНК включена в головку.
Использование харон-фагов к при клонировании фрагментов чужеродной ДНК
схематически изображено на рис. 9.14.
Библиотеки геномов
Одна из основных целей клонирования различных фрагментов ДНК
прокариотических и эукариотических организмов состоит в расчленении
геномов на участки, достаточно малые для того, чтобы было возможно их
детальное исследование. Интуитивно представляется очевидным, что, если
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 113 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed