Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.
Скачать (прямая ссылка):
нуклеотидные последовательности, представленные в геноме лишь в
единственном экземпляре, так и различные нуклеотидные последовательности,
каждая из которых многократно повторена в геноме. Так, например,
основываясь на кривой ренатурации, можно показать, что геном мыши
содержит сложный набор нуклеотидных последовательностей, частота
представленности которых в геноме схематически изображена на рис. 9.5.
Организация и возможные функции многократно повторяющихся нуклеотидных
последовательностей в геноме эукариот были в 60-х годах, после их
открытия, предметом активного обсуждения. Около 10% генома мыши
составляет совокупность тандемно расположенных последовательностей
примерно из 10 нуклеотидов, повторенных 106 раз (рис. 9.5). Эти
последовательности ДНК локализованы преимущественно в окружающем
центромеры гетерохроматине. Подавляющее большинство этих
последовательностей, по-видимому, играют какую-то роль в структурной
организации хромосом, поскольку они не транскрибируются в
последовательности РНК. С другой стороны, большинство последовательностей
с не столь высокой повторностью распределены по всему геному и
транскрибируются в РНК. Природа этих последовательностей активно
изучается методами рекомбинантных ДНК, о которых мы расскажем в этой
главе.
log |0 числа повторов
9. Методы работы с ДНК 265
Дополнение 9.1 Кинетика ренатурации ДНК
Этапы последовательной денатурации и ренатурации ДНК схематически
изображены на рис. 9.1. Ренатурация комплементарных одноцепочечных
молекул в двухцепочечную происходит в два этапа: 1) нуклеация
(зацепление), 2) застегивание (наподобие застежки-молнии). Поскольку
зацепление включает две одноцепочечные молекулы ДНК, скорость реакции
пропорциональна квадрату концентрации ДНК (измеряемому по молярности
нуклеотидов) и, следовательно, представляет собой реакцию второго
порядка. Напротив, в застегивании принимает участие уже единая
двухцепочечная молекула, и потому это реакция первого порядка, а с точки
зрения механизма -мономолеку-лярная. Экспериментально ренатурация ДНК
идет в соответствии с кинетикой реакции второго порядка. Следовательно,
лимитирующей стадией является установление первых связей между
одноцепочечными молекулами (зацепление).
Пусть с-концентрация одноцепочечных молекул ДНК в момент времени t, а с0-
концентрация в начальный момент t= 0. Тогда уравнение реакции второго
порядка, описывающее убывание концентрации одноцепочечной ДНК, имеет вид
¦ - -к с2 dt ~к2° '
О)
где к2 -постоянная скорости реакции второго порядка, или
de
- -г- - Kidt.
с
Интегрирование этого уравнения дает
- = k2t + const, с
При t = 0 с = с0, следовательно, const =
1
= -. Подставляя, получаем со
- = кл -\-----
1
1 + k2c0t
(2)
Время, за которое концентрация убывает вдвое (время полуренатурации),
обозначается t
0,5 :
откуда
1/2. Из предыдущего уравнения 1
1 +&2С0г1/2
C0f 1/2 - , fc,
(3)
На рис. 9.2 представлен график зависимости с/с0 от c0t, он называется
с0?-графиком.
Ветмур и Дэвидсон показали, что константа скорости реакции второго
порядка ренатурации ДНК к2 обратно пропорциональна IV- числу нуклеотидов
в неповторяющихся участках нуклеотидной последовательности гаплоидного
генома прокариот. Это соотношение задается формулой
ко =
оф3Ь°
лГ
(4)
где L-среднее число нуклеотидов в одноцепочечном фрагменте, р~ средняя
плотность точек, в которых устанавливается связь между двумя цепями, а-
коэффициент. Комбинируя уравнения (3) и (4), мы видим, что величина
c0t1/2 прямо пропорциональна N. (а - коэффициент пропорциональности):
соП/2 - а^-
(5)
Важность уравнения (5) демонстрируется рисунком 9.3, на котором
представлены кривые ренатурации фрагментов ДНК, полученных из молекул ДНК
различной сложности.
Для молекул ДНК, для которых известны значения L и N, коэффициент
пропорциональности а можно определить по
18-1215
266
Организация и передача генетического материала
набору значений c0t1/2, получаемых при различных условиях эксперимента
(при разных температурах и ионных силах раствора). В этом состоит один из
наиболее важных результатов исследования кинетики, а именно: используя
один и тот же набор условий эксперимента, можно по значению а рассчитать
N для ДНК неизвестной природы.
На рис. 9.4 сравниваются кривые ренатурации бактериальной ДНК и ДНК
эукариотических организмов. По форме кривой видно, что ренатурация
бактериальной ДНК происходит при неизменном значении константы скорости
реакции второго порядка, т. е. в соответствии с уравнением (2). Напротив,
кривая ренатурации ДНК эукариотического организма свидетельствует о том,
что в процессе ренатурации величина к2 должна изменяться. Для того, чтобы
интерпретиро-
вать кривые ренатурации ДНК типа изображенной на рис. 9.4, следует
предположить, что в ДНК эукариотических клеток присутствуют различные
типы нуклеотидных последовательностей, различающихся сложностью и
частотой повторов. Часть ДНК, ренатурирующая медленнее всего (т.е.
