Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.
Скачать (прямая ссылка):
геле. Фрагменты должны быть помечены радиоактивным изотопом, для того
чтобы их размер можно было определять путем радиоавтографии геля.
Принципы секвенирования изображены схематически на рис. 9.8.
Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу
радиоактивного мечения, и кроме того по способу выделения исходного
набора фрагментов. Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе,
разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент метят
радиоактивным изотопом 32Р в 5'-конце с использованием [у - 32Р] АТР и
фермента, называемого полинуклеотидкиназа. Затем комплементарные цепи
разделяют и в них независимо определяют последовательность нуклеотидов.
На рис. 9.8 изображена одна цепь; звездочка обозначает радиоактивную
метку 32Р на 5'-конце. Четыре отдельных образца этого фрагмента
подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется
четыре исходных набора фрагментов различной величины. Фрагменты каждого
из этих наборов на 5'-конце содержат радиоактивную метку, а на другом
конце - определенный нуклеотид (см. рис. 9.8). (При этом образуются также
наборы фрагментов с одинаковыми З'-кон-цами, однако, эти фрагменты не
попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной
метки). Затем четыре исходных набора фрагментов подвергают электрофорезу
в полиакриламидном геле "бок о бок". Положение каждого фрагмента в геле
можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом
обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту
определенного размера. Изображенная на рис. 9.8 последовательность
фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать
последовательность нуклеотидов, начиная с 5'-конца (т. е. снизу). На рис.
9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после
электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в
действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов
исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду.
214
Организация и передача генетического материала
Расщепление по С ~^
Расщепление_ по Т
- Расщепление- по А
Расщепление-, по G
Т
С
А
G
С
С
С
С
А
Т
G
G
Т
Т
А
А
G
А
4; 4: 4: 4: 4:
I (
* * * *
Т I
4: 4: * * * * * * *
!
А |
A j i А I
1 ! i
G j I
Получение исходных наборов радиоактивно меченных фрагментов
Рис. 9.8. Основные принципы определения нуклеотидной последовательности
нуклеиновых кислот. Меченные радиоактивным изотопом (*) фрагменты
одноцепочечной ДНК подвергают химической обработке четырьмя различными
методами, в результате чего образуются четыре группы фрагментов, в каждой
из этих групп фрагменты слу-
о Радиоав-
Н
5 тография и электрода* форетичес-кого геля х выявляет 5 различия " в
длине
| А--------
В
фрагмен-
тов
чайной длины оканчиваются определенным нуклеотидом. Все четыре набора
фракционируют затем по размерам посредством электрофореза. Нуклеотидная
последовательность при этом может считываться непосредственно с
радиоавтографа электрофоретического геля (последовательность стрелок от
полосы к полосе на диаграмме).
9. Методы работы с ДНК
275
Рис. 9.9. Радиоавтограф электрофоретического геля, по которому считывают
нуклеотидную последовательность методом Максима - Гилберта. Изображена
последовательность нуклеотидов, заключенная между двумя генами а-гло-бина
ДНК человека. Фрагмент ДНК был помечен на З'-конце и обработан рестрикта-
зами, расщепляющими по G, С, G и А и С и Т (для определения нуклеотидной
последовательности нет необходимости в том, чтобы расщепление цепи
происходило по единственному основанию). Слева представлена
последовательность, которую можно считать с геля.
Т
G
3'
Метод рекомбинантных ДНК
Ферменты рестрикции позволяют вырезать любые произвольные фрагменты ДНК и
комбинировать из них in vitro рекомбинантные (или химерные) молекулы. Это
оказывается возможно, поскольку многие рестриктазы разрезают двойную
спираль так, что место разреза одной цепи сдвинуто относительно второй, в
результате чего образовавшиеся фрагменты обладают комплементарными
одноцепочечными концами (см. табл. 9.1). Эти концы могут соединяться
посредством образования водородных связей между комплементарными
основаниями, причем сшиваться таким образом могут различные фрагменты
ДНК, как это показано на
216
Организация и передача генетического материала
Рис. 9.10. Образование рекомбинантных молекул ДНК. При действии одной
рестриктазы на различные молекулы ДНК образуются фрагменты с
комплементарными одноцепочечными концами. Соединение таких фрагментов в
разных сочетаниях может приводить к образованию рекомбинантных молекул
ДНК. Под действием ДНК-лигазы формирование рекомбинантных молекул
завершается установлением ковалентных связей.
AGAGAATTCCCT
TCTCTTAAGGGA
AGAGAATTCCCT
TCTCTTAAGGGA
AGAG ААТТСССТ
ТСТСТТАА GGGA
AGAG ААТТСССТ
ТСТСТТАА GGGA
AGAGAATTCCCT
TCTCTTAAGGGA
AGAGAATTCCCT
TCTCTTAAGGGA
рис. 9.10. После образования водородных связей между комплементарными
