Антибактериальные лекарственные средства. Методы стандартизации препаратов - Хабриев Р.У.
ISBN 5-255-04072-1
Скачать (прямая ссылка):
Среди возбудителей болезней человека известны также и некультивируемые виды бактерий, например Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, и многие виды вирусов, включая вирусы папилломы человека и гепатита С. Попытки выращивания их в клеточной культуре пока остаются безуспешными. Наконец, даже при успешном культивировании существует необходимость последующей идентификации выделенных микроорганизмов [3]. Традиционные микробиологические методы идентификации основаны на использовании различных фенотипических тестов, таких, как выявление специфической ферментативной активности, способности метаболизировать сахара или поддерживать рост на средах с селективными добавками. Сложность стандартизации условий подобных тестов, а также естественная фенотипическая вариабельность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации.
3.2. Методы иммунологического контроля
Культуральная диагностика внутриклеточных возбудителей доступна только специализированным лабораториям, поэтому общепринятым методом является серотипирование.
Используют реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) и связывания комплемента (РСК). Для всех возбудителей доказательным является 4-кратное увеличение титров антител в парных сыворотках крови, взятых с интервалом в 2 нед. Эти методики фактически обеспечивают лишь ретроспективную диагностику. В последние годы для диагностики микоплазменной инфекции исследуют сыворотку крови на наличие специфических антител к Mycoplasma pneumoniae классов IgM и IgG иммуноферментным методом ELISA. Повышенные концентрации антител класса IgM свидетельствуют об острой фазе инфекционного процесса, затем повышаются концентрации антител класса IgG, которые могут сохраняться длительное время. Этот метод более чувствителен по сравнению с РСК и РНИФ и, как правило, не требует, изучения парных сывороток. Тест ELISA может также использоваться
43
для обнаружения антигена микоплазмы в мокроте. Для определения концентрации специфических антител к хламидиям в сыворотке крови кроме РСК и РНИФ также может применяться ELISA [31]. Для диагностики урогенитального хлами-диоза используется метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) [5].
3.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Современная медицина успешно использует достижения естественных наук, интенсивно применяет новые технологии для диагностики и лечения заболеваний. В последнее время к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний добавились новые, основанные на использовании моле-кулярно-генетических технологий.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro.
Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом — ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК «с нуля», ей необходима короткая «затравочная» цепь РНК или ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды.
Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности.
В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые «ограничивают» амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-мат-рицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Стандартная ПЦР может быть осуществлена за 1-3 ч.
Использование ПЦР в медицинской микробиологии
Среди множества различных направлений клинической диагностики медицинская микробиология занимает, пожалуй, лидирующее место по количеству и разнообразию приложений, использующих технологию ПЦР. Внедрение в
44
практику этого метода наряду с серологической диагностикой существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах или в культуре клеток.
Использование ПЦР для прямой диагностики и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний
В тех случаях, когда использование культуральных методов является проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффективностью, возможность замены биологической амплификации (т. е. роста на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых кислот in vitro с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидий-ной ДНК в исследуемых образцах [8]. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммунофермент-ный анализ), традиционно используемые для выявления С. trachomatis.
