Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
4.4.6, Изотахофорез
Этот метод также основывается на принципе фронтального электрофореза (метод подвижной границы, разд. 4.1). В зависимости от применяемого оборудования разделение проводят либо в горизонтальном, либо в вертикальном направлении. Раствор, в котором происходит разделение, обычно представляет собой водную среду, содержащую сахарозу для обеспечения более высокой плотности. К образцу добавляют по одному виду ионов с высокой и низкой электрофоретической подвижностью (например, ионы хлора и гли-
136 Часть //. Методы разделения
цината соответственно); оба иона имеют тот же заряд, что и разделяемые ионы образца. Все они будут иметь противоионы.
После нанесения образца включают ток; ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми. На некотором расстоянии от них следуют самые малоподвижные ионы, а ионы образца, обладающие промежуточной подвижностью, располагаются между ними соответственно их относительным подвижностям. Если подвижности ионов образца очень близки, разрешение можно улучшить путем внесения в исходный образец синтетических амфолитов, называемых ионами-прокладками. Эти ионы по сравнению с ионами образца обладают промежуточной подвижностью и, располагаясь между ними, способствуют разделению последних. Ионы-прокладки сходны с теми, которые применяются при электрофокусировании. Они создают градиент pH между ведущими и замыкающими ионами, способствуя тем самым дополнительному разделению ионов образца по принципу электрофокусирования. Изотахофорез обладает очень высокой разрешающей способностью и применяется как для аналитического, так и для препаративного разделения самых разнообразных веществ.
4.5. Применение электрофореза
Электрофорез используется для разделения молекул, несущих суммарный заряд. Низковольтный электрофорез на бумаге нашел широкое применение для разделения аминокислот, пептидов, белков, нуклеотидов, нуклеиновых кислот и заряженных производных углеводов. Однако при низковольтном электрофорезе на бумаге имеет место значительная диффузия малых молекул, поэтому для их разделения применяют, как правило, высоковольтный электрофоре», при котором время разделения сводится до минимума и вследствие этого уменьшается диффузия. Вместо бумаги в качестве носителя зачастую используют ацетат целлюлозы, высокая чистота которого обусловливает уменьшение адсорбции образца, а следовательно, и лучшее разделение его компонентов. Одним из преимуществ ацетата целлюлозы является также его слабое фоновое окрашивание, что облегчает выявление соединений после разделения. Электрофорез на ацетате целлюлозы нашел широкое применение в клинике для разделения белков сыворотки крови (включая гликопротеиды и липопротеиды) и гемоглобинов; он применяется также при иммуноэлектрофорезе. Высоковольтный электрофоре», как бумажный, так и тонкослойный, используется для разделения аминокислот, концентрация которых в плазме крови и моче при различных нарушениях обмена может быть довольно высокой. Особенно велика ценность тонкослойного электрофореза при разделении малых молекул, таких, как аминокислоты и нуклеотиды, поскольку
Гл. 4. Электрофорез 137
этот метод отличается быстротой разделения и хорошей разрешающей способностью; кроме того, разделение можно проводить в двух направлениях, что позволяет получать «отпечатки пальцев» гидролизатов белков и нуклеиновых кислот. Тонкослойный электрофорез применяется также для разделения аминов, нафтолов, фенолов и неорганических ионов,.
Применение в качестве носителей гелей значительно расширило возможности этого метода и сферу его применения. Большим преимуществом метода является возможность варьирования степени (пористости геля, что позволяет улучшать разделение молекул, обладающих близкими зарядами, но различающихся по размерам и (или) форме. Вследствие этого гель-электрофорез чрезвычайно удобен для разделения смесей нуклеиновых кислот (особенно молекул РНК) и белков (включая ферменты, изоферменты и структурные белки). Степень пористости крахмальных и агаровых гелей не удается контролировать до такой степени, как полиакриламидных, но они также оказались весьма полезными при разделении смесей различных высокомолекулярных соединений.
Электрофокусирование и изотахофорез, обладая хорошим разрешением, применяются при аналитических исследованиях, но, подобно непрерывному электрофорезу, особенно широко используются для препаративных целей. Этими методами можно разделять относительно большие количества материала, который в конце разделения может быть получен обратно. С их помощью успешно проводили выделение пептидов, белков, нуклеотидов и т. д.
Рекомендуемая литература
Nernberg S. Т., Electrophoresis: A Practical Laboratory Manual, 2nd edn. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1972.
Sargent J. R„ Methods in Zone Electrophoresis. 2nd edn. British Drug Houses Chemicals Ltd., Poole, Dorset, 1969.
Shaw D. J., Electrophoresis. Academic Press, London, 1969.
Smith /., Chromatographic and Electrophoretic Techniques. Vol. 2, 2nd edn. Heinemann, London (1968).
