Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
Можно указать три основные причины радикального изменения химической активности функциональных групп, включенных в макромолекулу белка.
1. Часть функциональных групп скрыта внутри • глобулы и, еле-
. довательно, недоступна для химических реагентов (до, тех пор, дока федок сохраняет нативную структуру). Так, в сравнительно небольшом белке — карбоксипептидазе А — полностью: скрыты, внутри глобулы один остаток тирозина и два триптофана; 13 остатков тирозина и 6 — триптофана находятся в поверхностном слое и частично доступны растворителю. Только четыре остатка тирозина погружены р окружающую белок воду и могут проявлять такие же химические .свойства, как тирозин в небольших пептидах. Реакции химической модификации, рассчитанные на полное замещение всех доступных групп данного типа, используют для подсчета, и идентификации скрытых (англ. buried) функциональных групп.
. 2. Многие функциональные группы контактируют с. соседними группировками в белке, образуя своеобразные ансамбли. Участие в таких ансамблях способно сильно', Подчас до полной неузрараемости, изменить реакционную способность партнеров. Это подтверждается, в частности, тем, что константы диссоциации и соответствующие, им рКа ионогенных групп белка лежат в весьма широких диапазонах, иными словами, кислотно-основные свойства этих групп сильно зависят от их микроокружения. »
Так, в небольших пептидах онкарбоксильные, группы боковых цепей аспарагиновой и глутаминовой кислот имеют,рКа, близкий 4,7, будучи похожими в этом отношении на карбоксил уксусной и других алифатических карбоновых кислот. Во всей совокупности белков, однако, их рКа охватывают огромный интервал: от 1,5 (одна их карбоксильных групп активного центра пепсина) до 7,5 (карбоксильная группа остатка Glu^49 в а-субъединице триптофансинтетазы). Таким образом, в белках карбоксильные группы могут выступать и как весьма сильные кислотные группировки, практически полностью диссоциированные в физиологическом диапазоне pH, и как очень слабые, диссоциированные едва ли наполовину даже в нейтральной среде, а их константы диссоциации могут изменяться на шесть порядков.
Изменение реакционной способности той или иной функциональной группы может быть вызвано не только ее взаимодействием с какой-то другой группой (например, со второй карбоксильной группой, одна из которых становится сильной, а другая — слабой кислотой), но и локальным изменением полярности микроокружения данной группы. Например,, полагают, что погружение /^-карбоксильной группы остатка Glu-35 в гидрофобный участок Лизоцима куриного яйца затрудняет диссоциацию протона, поскольку образующийся при этом анион не может стабилизироваться гидратацией; рКа этой группы близок 6.
3. Поверхность белковой глобулы далеко не безразлгшна к реагентам, применяемым при модификации. Даже если эти реагенты не 182
содержат специально подобранных структур, способствующих избирательному связыванию в той или иной зоне белка (так называемая аффинная модификация), они с большой вероятностью будут связываться белком за счет взаимодействия с заряженными группами, гидрофобными участками поверхности, донорами или акцепторами водородных связей и т.п. Таким образом, собственно модификации предшествует связывание piatента определенным участком белковой структуры. Это приводит как бы к локальному концентрированию реагента в данной точке белковой молекулы и резко повышает вероятность вступления в реакцию функциональных групп, возможно, случайно соседствующих с участком связывания реагёнта.
Нетрудно видеть, что отмеченные выше особенности поведения белка в реакциях химической модификации не случайны, а отражают фундаментальные свойства его структурной организации и функционирования. С методической точки зрения это означает, что при трактовке результатов химической модификации нельзя полагаться на сведения о реакционной способности соответствующих групп в модельных соединениях. Строго говоря, в каждом случае после проведения реакции и выделения продукта модификаций (или разделения, если их несколько) необходимо прямыми методами установить, какие имен-, но функциональные группы данного белка подвергались модификации, и определить, каким аминокислотным остаткам в полипептидной цепи белка они принадлежат. Таким образом, приводимый далее обзор реагентов и их реакций с функциональными группами белка дает лишь общую ориентировку относительно возможностей применения метода химического модифицирования.
I •
9.2. ТИПОВЫЕ РЕАКЦИИ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП БЕЛКА
. / ' v V
9.2.1. е-Амююгрушш
е-Аминогруппы принадлежат боковым цепям остатков лизина. Они располагаются, как правило, на поверхности глобулы, достаточно доступны и обладают химическими свойствами, характерными для алифатический первичных аминов. рК* этих груцп обычно близок 10, поэтому реакции с этими группами проводят в слабощелочных средах при pH 8 и выше, т.е. в условиях, когда они хотя бы частично депрото-нированы и могут выступать в качестве нуклеофильных агентов. Заметим, что о-аминогруппы реагируют сходным образом, однако на их реакционной способности сказывается несколько меньшая основность (рКа около 8).
