Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
В свете обсужденных данных о ренатурации белков in vitro очевидно, что свертывание белка, предопределенное его первичной структурой, может быть во многих случаях воспроизведено с достаточно хорошим выходом. Помимо рассмотренных выше кинетических ограничений следует учитывать и то, что in vivo пространственная структура в норме формируется каждой вновь синтеэируемви молекулой в отдельности, без накопления развернутых, денатурированных структур.
Роль последнего фактора стала особенно очевидной при сверхсинтезе чужеродных белков в микробных клетках. В таких системах нередко наблюдается накопление внутри клеток-продуцентов так называемых тел включения, которые представляют собой агрегаты денатурированных пептидных цепей. Если белок содержит дисульфидные связи, в таком агрегате они образуются беспорядочно, во многих случаях межмолекулярно. Возникновение агрегатов можно объяснить тем, что при интенсивно протекающем сверхсинтезе одновременно на многих рибосомах образуются лишенные структуры пептидные цепи, появление которых значительно опережает процесс свертывания. Как следствие, молекула не успевает "перебрать" промежуточные конформации и найти путь свертывания. Вместо этого она агрегирует с соседними, также еще не свернутыми полипептидными цепями.
Как правило, отделение тел включения от других компонентов клетки проходит без затруднений, что облегчает их очистку. Однако в дальнейшем возникает непростая проблема ренатурации полученного белка, для которой во многих случаях так и не удается отыскать удовлетворительное решение. Обычный прием состоит в том, что агрегированный белок сначала переводят в раствор и добиваются полного разрушения агрегатов, применяя концентрированные мочевину или солянокислый гуанидин в присутствии соединений, восстанавливающих дисульфидные связи (например, меркаптоэтанола). Затем прибегают к более или менее плавному удалению денатурирующего реагента и восстановителя, создавая условия постепенной ренатурации белка,
137
причем поддерживают'низкую концентрацию последнего. Для образования дисульфидных связей применяют мягко действующую окислительно-восстановительную систему, например смесь 10 мМ окисленного и 1 мМ восстановленного глутатиона. В ряде случаев такой прием дает хорошие результаты: так, практически количественно проходит ренатурация интерлейкина-2, полипептидная цепь которого состоит из 133 аминокислот и содержит одну дисульфидную связь и один "непарный'1 остаток цистеина.
Ренатурация мембранных белков представляет собой отдельную задачу. Транс мембранный белок — бактериородопсин — после его экстракции из мембраны и хроматографической очистки в смеси органических растворителей удалось рёНатурировать, поместив в смесь фосфолипида и поверхностно-активного соединения. Очевидно, что и в этом случае самосборка белка в присутствии липида приводит от денатурированной молекулы к структуре, свернутой так же, как нативный белок.
Таким образом, ренатурация белка принципиально возможна и во многих случаях практически осуществима, однако ряд препятствий, преимущественно кинетических, может серьезно-затруднить, а иногда полностью остановить этот процесс. Необходимо подчеркнуть, что способность полипептидной цепи белка самопроизвольно образовывать пространственную структуру еще не означает, что в реальных условиях биосинтеза этот процесс протекает без участия внешних факторов, в том числе ряда белков, выступающих как катализаторы свертывания полипептидной цепи.
Одной из причин замедленного формирования пространственной структуры белка in vivo могла быть задержка в образовании дисульфидных связей. Существует так называемый перегруппировывающий фермент — протеиндисулъфидизомераза, — ускоряющий перебор возможных дисульфидных связей и тем самым поиск правильно образованных. В его присутствии ренатурация протекает гораздо быстрее. Так, 70%-ная ренатурация панкреатической рибонуклеазы при действии этого фермента, выделенного из печени, происходит уже за 30 мин, тогда рак спонтанная реактивация за это время так мала, что еще не обнаруживается.
Протеиндисульфидизомераза в эукариотических клетках содержится в эндоплазматическом ретикулуме и является димерным белком, каждая из. субъединиц которого содержит два домена, структурно близких тиоредоксину, небольшому белку, участвующему в окислительно-восстановительных процессах. Каждый из» этих доменов, види-
¦1 I
мо, и содержит каталитический центр, в котором имеется группировка из двух остатков цистеина (восстановленная форма), способных рас-
138
щеплять дисульфидную связь в белке-субстрате, образуя за этот счет собственную дисульфидную связь (окисленная форма). В свою Очередь, окисленная форма протеиндисульфидизомеразы, реагируя со свободными SH-группами цистеина в субстрате, вызывает образование в этом белке дисульфидной связи, чем и обусловлен быстрый перебор в нем всех возможных дисульфидных мостиков: