Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
Эффективными денатурирующими ! агентами ЯвляЮтСя ионные детергенты, среди которых особенно частб ис’пользуют анионный
детергент — додецилсульфат натрия: ' ' ' ‘ " ''
• . : •> • "¦ л
CH3-(CH2)ii4JS03Na*
. Его длинная гидрофобная цепь образует контакты с гидрофобными остатками белка, что при концентрации детергента около 0,5 мМ приводит к полному развертыванию третичной структуру. Взаимное отталкивание практически всегда отрицательно заряженных сульфатных групп влечет зр собой вытягивание комплекса додецилсулъфат гт белок в палочковидную структуру, ¦ несущую столь большое число отрицательных зарядов додецилсульфата, что вклад собственных ионных групп белка оказывается, как правило (но не всегда!),, малосущественным. Такой способ денатурации нащел широкое, црименецие при электрофоретических исследованиях белков в полиакриламидном геле. /
; Как и при действии других денатурирующих агентов, развертывание белка в присутствии додецилсульфата происходит скачкообразно. Например,, бактериальная рибонуклеаза — барназа — при 0,65 мМ детергента и 37 °С связывает сразу 14 молекул додецилсульфата на одну молекулу белка, состоящую из 110 аминокислотных остатков. При меньших концентрациях реагента белок сохраняет стабильность и комплекса с детергентом практически не образует. , f .
Подвижность отрицательно заряженных комплексов ..додеодлсульфат — белок в силу примерно одинаковой плотности заряда (как правило, связывается практически постоянное количество додецилсульфата: примерно 0,4 г на 1 г, белка), а также одинаковой (палочковидной) формы комплексов определяется только длиной, полипецтидной цепи. Это сделало- электрофорез в присутствии додецилсульфата наиболее распространенным способом определения молекулярной массы полипептидных цепей. Сказанное справедливо, если в белке нет дисульфидных связей, которые не позволят цепц развернуться в линейную структуру. I Ввиду этого денатурацию додецилсульфатом натрия обычно дополняют восстановлением дисульфидных связей меркаптоэта-нолом или дитиоэритритом. Иногда обработку детергентом ведут при 100 “С, добавляя в смесь концентрированную мочевину, с тем чтобы обеспечить наиболее полную денатурацию белка.
130
Денатурация белка может происходить и при экстремальных значениях pH. Так, в сильно кислых растворах полностью протонируются отрицательно заряженные карбоксильные группы остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Это приводит к тому, что на поверхности белка сохраняются, только положительные заряды катионных групп, взаимное отталкивание которых приводит к развертыванию глобулы, одновременно протоны разрывают ряд водородных связей. В щелочных растворах (при pH 11 и выше) утрачивают положительные заряды аминогруппы лизина и приобретают отрицательные — фенольные группы тирозина, что опять-таки ведет к резкому преобладанию отрицательных зарядов и развертыванию глобулы. Этому же способствует и разрыв ряда водородных связей, в том числе Образованных водородом фенольных групп тирозина. Известны, однако, белки, адаптированные, например, к высокой кислотности. Так, пепсин сохраняет свою структуру и активность при pH 1—2. Этому, видимо, благоприятствует почти полное отсутствие катионных групп в этом белке.
Установить полноту денатурации, т.е. полное исчезновение системы нековалентных взаимодействий, свойственных нативной структуре, довольно трудно. Обычно ограничиваются тем, что наблюдают за изменением какого-либо характерного для пространственной структуры белка физического параметра, например дисперсии оптического вращения или спектра флуоресценции, при углублении условий денатурации — повышении концентрации мочевины, росте температуры и т.п. Полагают, что денатурация завершилась, если наблюдаемый параметр достигает некоторого предельного значения, например если спектр флуоресценции перестает изменяться, достигнув формы, характерной для белка, в котором все остатки триптофана и тирозина равно доступны растворителю. Разумеется, это не дает полной гарантии исчезновения всех нековалентных контактов, однако можно надеяться на отсутствие протяженных элементов третичной структуры, сохраняющих кооперативность.
Денатурация белка нередко осложняется повреждением его ковалентной структуры. Так, продолжительное действие мочевины при пйвыщенной температуре может сопровождаться карбамилированием аминогрупп лизина:
-СН2-СН2^Ш2 + NH2-C0-NH2 —> -CH2-€H2-NH-€0-NH2 + NH3
Лизин Гомоцитруллин
(В действительности реакция, видимо, протекает с участием циановой кислоты HNC0, находящейся в равновесии с мочевиной .)
131
Довольно часто наблюдается гидролиз амидных групп аспарагина и глутамина (дезамидирование), в особенности если в белке есть последовательность Asn—Gly. К целому ряду повреждений, в том числе к расщеплению остатков цистина с образованием дегидроаланина, ведет щелочная обработка белков. Все эти факторы следует контролировать, что становится критически важным, если имеется в виду ренатурация белка — перевод денатурированного белка в нативное состояние.
